Расширение дрожжи один гибрид экраны для определения фактора транскрипции, привязка к последовательности ДНК человека
Summary
Здесь мы представляем расширенной дрожжи один гибрид скрининг протокол для выявления факторов транскрипции (TFs), которые можно привязать к человеческой ДНК региона интерес. Этот метод использует высокопроизводительного скрининга трубопровода, который может допрашивать связывание > 1000 TFs в одном эксперименте.
Abstract
Определение набора факторов транскрипции (TFs), которые регулируют каждого человека ген является сложной задачей, которая требует интеграции многочисленные экспериментальные и расчетные подходы. Один из таких методов является дрожжи пробирного один гибрид (Y1H), в котором взаимодействие между TFs и ДНК регионах тестируются в обстановке дрожжи ядра с помощью репортер генов. Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например., промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для активации Репортер ген. Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H экраны основаны на преобразования библиотеки TF-добычу или массивов в ДНК приманка штаммов дрожжей. Здесь мы описываем трубопровода, называется расширенной Y1H assays (eY1H), где допрашивают TF-ДНК взаимодействия путем спаривания ДНК приманка штаммы с выстроились коллекции штаммов TF-добычу, используя массив высокой плотности (HDA) Роботизированная платформа, которая позволяет скрининга в 1536 колонии формат. Это позволяет резкое увеличение пропускной способности (60 последовательностей ДНК приманка против > 1000 TFs занимает две недели за исследователь) и воспроизводимость. Мы иллюстрируют различные виды ожидаемых результатов путем тестирования человека промоутер последовательности против массив 1086 человека TFs, а также примеры вопросов, которые могут возникнуть во время экраны и способы их устранения.
Introduction
Центральная проблема в области биомедицины, является определение механизмов, которыми регулируется каждого человека ген. Транскрипция является первым шагом в борьбе уровни выражения гена, и он регулируется наборы факторов транскрипции (TFs), которые являются уникальными для каждого гена. Учитывая, что люди кодировать для > 1500 TFs1,2, определить полный набор TFs, которые контролируют выражение каждого гена остается открытым вызовом.
Два типа методов может использоваться для сопоставления TF-ДНК взаимодействий: TF-центре и ДНК центру методы3 (рис. 1A). TF-центру методов TF интереса является зондируемой для привязки геномной ДНК регионов или для определения его специфика связывания ДНК. Эти методы включают в себя иммунопреципитации chromatin (чип) следуют высокопроизводительного секвенирования, microarrays протеина привязки и SELEX4,5,6. В ДНК центру методов последовательность ДНК интереса является зондируемой определить набор TFs, привязанные к последовательности ДНК. Наиболее широко применяемым из таких методов является дрожжи один гибрид анализов (Y1H), в которых взаимодействия между TFs и ДНК регионах тестируются в среде дрожжи ядра с помощью репортер генов7,8,9.
Y1H анализы включают два компонента: «ДНК приманка» (например, промоутеров, усилители, глушители и т.д.) и «TF-добычу,» которые могут проверяться для Репортер ген активации9,10 (рис. 1B). ДНК приманка клонируется вверх по течению два репортера генов (LacZ и HIS3) и оба ДНК bait::reporter конструкции интегрированы в геноме дрожжи для создания chromatinized ДНК приманка штаммов. TF-добычу, закодированные в плазмиды, выражающий TF сливается для активации домена (AD) дрожжей Gal4 TF, вводится в штамм ДНК приманка для ловли TF-ДНК взаимодействия. Если TF-добычу связывает последовательности ДНК приманка, AD, присутствующих в TF-добычу приведет к активации как репортер генов. В результате клетки с позитивного взаимодействия может выбран для роста на пластины не хватает гистидина, а также преодоление конкурентный ингибитор, 3-амино-1,2,4-триазола (3-AT) и визуализируется как синий колоний в присутствии X-Гал. Потому что мощным дрожжи Gal4 объявление используется, Y1H анализов может обнаруживать взаимодействия с участием transcriptional активаторы, а также подавляющего. Кроме того учитывая, что TF-preys выражаются от сильного дрожжи промоутер (ADH1), взаимодействия могут быть обнаружены даже для TFs, которые имеют низкий эндогенного выражение уровней, которые являются сложными для обнаружения на чип11,12.
Наиболее опубликованные протоколы для выполнения Y1H анализы основаны на внесении TF-preys в ДНК приманка штаммов дрожжей путем преобразования пуле TF-добычу библиотек, последующим выбор, колонии комплектации и последовательности для определения взаимодействующих TF, или Преобразование отдельных клонов8,9. Это трудоемкий протоколы, ограничивая число последовательностей ДНК, которые могут быть проверены на исследователь. Недавнее улучшение анализов Y1H, называется расширение Y1H (eY1H), резко возросли скрининга пропускную способность с помощью высокой плотности массив (HDA) Роботизированная платформа для каждого выражения разных мат штаммов дрожжей ДНК приманка с коллекцией штаммов дрожжей TF-добычу10,13 (рис. 1 c). Эти экраны используют 1.536 колонии формат, позволяющий проверить большинство человеческих TFs в составленном, используя только три пластины. Кроме того, учитывая, что TF-ДНК взаимодействия тестируются на основе pairwise, этот подход позволяет для сравнения взаимодействий между ДНК приманок (например, два варианта некодирующей единичных нуклеотидных) и между различными TFs или TF варианты11,12 ,14.
С помощью eY1H анализов, мы разделенное крупнейший человека и Caenorhabditis elegans TF-ДНК, ДНК центру взаимодействия сетей к дата. В частности мы определили 2,230 взаимодействий между 246 человеческого развития усилителей и 283 TFs12. Кроме того мы использовали eY1H анализов для выявления измененных TF привязки 109 единичных нуклеотидных некодирующей варианты, связанные с генетическими заболеваниями, такими как пороки развития, рак и неврологических расстройств. Совсем недавно мы использовали eY1H для разграничения сети, состоящей из 21,714 взаимодействий между 2576 C. elegans генным стимуляторам и 366 TFs11. Эта сеть была инструментальная раскрыть функциональные роли десятки C. elegans TFs.
Протоколы для создания ДНК приманка пятна и оценивать уровни фоновой активности репортер были сообщила других15,16,17. Здесь мы описываем eY1H трубопровода, которые могут использоваться для экран любого человека геномной ДНК региона против массив 1086 человека TFs. После того, как формируется дрожжей штамма ДНК приманки и TF-добычу массив выставляется на соответствующий пластин, весь протокол могут быть выполнены в две недели (Таблица 1). Что еще более важно протокол можно распараллелить так, что один исследователь может одновременно экрана 60 последовательностей ДНК приманки. Чтобы продемонстрировать протокол, мы экранированный промоутеров двух генов цитокинов, CCL15 и IL17F. Кроме того мы показываем результаты от неудачных экранов проиллюстрировать типы проблем, которые могут возникнуть при выполнении eY1H анализов и способы их устранения.
Protocol
Representative Results
Discussion
Робот eY1H спаривания скрининг подход, описанный здесь значительно увеличивает пропускную способность для определения набора TFs, привязанные к ДНК региона интерес, по сравнению с предыдущей библиотеки скрининга или выстроились скрининг подходы, основанные на преобразование. Кроме того…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана национальных институтов здравоохранения [R35-GM128625 до J.I.F.B.].
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
References
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
