बढ़ाया खमीर एक संकर स्क्रीन मानव डीएनए दृश्यों के लिए प्रतिलेखन कारक की पहचान करने के लिए
Summary
यहां, हम एक बढ़ाया खमीर एक संकर स्क्रीनिंग प्रोटोकॉल प्रस्तुत करने के लिए प्रतिलेखन कारकों (TFs) कि ब्याज की एक मानव डीएनए क्षेत्र को बांध कर सकते है की पहचान । यह विधि एक उच्च-प्रवाह जांच पाइपलाइन का उपयोग करता है जो एक ही प्रयोग में > 1000 TFs के बंधन पूछताछ कर सकते हैं ।
Abstract
प्रतिलेखन कारकों (TFs) है कि प्रत्येक मानव जीन को विनियमित के सेट की पहचान एक चुनौतीपूर्ण काम है कि कई प्रयोगात्मक और गणना के दृष्टिकोण को एकीकृत करने की आवश्यकता है । ऐसा ही एक तरीका है खमीर एक संकर (Y1H) परख, जिसमें TFs और डीएनए क्षेत्रों के बीच बातचीत खमीर रिपोर्ट जीन का उपयोग नाभिक के वातावरण में परीक्षण कर रहे हैं । Y1H परख दो घटकों को शामिल: एक ‘ डीएनए ‘ चारा (जैसे,प्रवर्तकों, बढ़ाने, silencers, आदि) और एक ‘ TF-शिकार, ‘ जो रिपोर्टर जीन सक्रियण के लिए जांच की जा सकती है । Y1H स्क्रीन के प्रदर्शन के लिए सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल TF-शिकार पुस्तकालयों या arrays डीएनए-चारा खमीर उपभेदों में बदलने पर आधारित हैं । यहां, हम एक पाइपलाइन का वर्णन, बढ़ाया Y1H बुलाया (eY1H) परख, जहां tf-डीएनए बातचीत एक उच्च घनत्व सरणी (HDA) रोबोट मंच है कि एक १,५३६ में स्क्रीनिंग की अनुमति देता है का उपयोग कर tf-शिकार उपभेदों का एक सरणी संग्रह के साथ डीएनए-चारा उपभेदों संभोग द्वारा पूछताछ कर रहे है कॉलोनी प्रारूप । यह प्रवाह में एक नाटकीय वृद्धि के लिए अनुमति देता है (६० डीएनए-चारा अनुक्रम > 1000 TFs के खिलाफ दो सप्ताह के शोधकर्ता प्रति लेता है) और reproducibility । हम १,०८६ मानव TFs की एक सरणी के खिलाफ मानव प्रवर्तक अनुक्रम परीक्षण द्वारा अपेक्षित परिणाम के विभिंन प्रकार के उदाहरण देकर स्पष्ट करना है, साथ ही मुद्दों है कि स्क्रीन के दौरान पैदा कर सकते है और कैसे उंहें समस्या निवारण के उदाहरणों के रूप में ।
Introduction
जैव चिकित्सा क्षेत्र में एक केंद्रीय समस्या तंत्र है जिसके द्वारा प्रत्येक मानव जीन विनियमित है निर्धारित है । प्रतिलेखन जीन अभिव्यक्ति के स्तर को नियंत्रित करने में पहला कदम है, और यह प्रतिलेखन कारकों (TFs) है कि प्रत्येक जीन के लिए अद्वितीय है के सेट द्वारा विनियमित है । यह देखते हुए कि मनुष्य > 1500 tfs1,2के लिए सांकेतिक शब्दों में बदलना, tfs का पूरा सेट है कि प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति नियंत्रण की पहचान एक खुली चुनौती बनी हुई है ।
दो प्रकार की विधियों को tf-dna इंटरैक्शन मैप करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है: tf-केंद्रित और डीएनए-केंद्रित तरीके3 (आंकड़ा 1a) । tf-केंद्रित विधियों में, जीनोमिक डीएनए क्षेत्रों के लिए बाइंडिंग के लिए या इसकी डीएनए बाइंडिंग विशिष्टता निर्धारित करने के लिए ब्याज की एक tf जांच की जाती है । इन विधियों में उच्च-प्रवाह sequencing, प्रोटीन बाइंडिंग microarrays, और SELEX4,5,6के बाद क्रोमेटिन immunoprecipitation (चिप) शामिल हैं । डीएनए में-केंद्रित तरीकों, ब्याज की एक डीएनए अनुक्रम TFs के सेट है कि डीएनए अनुक्रम को बांध निर्धारित करने के लिए जांच की है । इस तरह के तरीकों का सबसे व्यापक रूप से लागू खमीर एक-संकर (Y1H) परख है, जिसमें TFs और डीएनए क्षेत्रों के बीच बातचीत खमीर के वातावरण में परीक्षण कर रहे है के लिए रिपोर्ट जीन7,8,9का उपयोग कर नाभिक ।
Y1H परख दो घटकों को शामिल: एक ‘ डीएनए ‘ चारा (जैसे, प्रवर्तकों, बढ़ाने, silencers, आदि) और एक ‘ TF-शिकार, ‘ जो रिपोर्टर जीन सक्रियण9,10 (आंकड़ा 1b) के लिए जांच की जा सकती है । डीएनए-चारा दो रिपोर्टर जीन (LacZ और HIS3) और दोनों डीएनए-चारा के ऊपर की क्लोन है: रिपोर्टर constructs खमीर जीनोम में एकीकृत करने के लिए chromatinized ‘ डीएनए-चारा उपभेदों उत्पंन कर रहे हैं । tf-शिकार, एक प्लाज्मिड है कि एक tf सक्रियकरण डोमेन (AD) खमीर Gal4 tf के लिए जुड़े हुए व्यक्त करता है में इनकोडिंग, डीएनए चारा तनाव में TF-डीएनए बातचीत के लिए मछली के लिए शुरू की है । यदि tf-शिकार को डीएनए-चारा अनुक्रम में बांधा जाता है, तो tf-शिकार में मौजूद विज्ञापन दोनों रिपोर्टर जीन की सक्रियता को जन्म देगा. नतीजतन, एक सकारात्मक बातचीत के साथ कोशिकाओं histidine कमी प्लेटों पर विकास के लिए चुना जा सकता है, के रूप में अच्छी तरह से एक प्रतियोगी अवरोध करनेवाला पर काबू पाने, 3-अमीनो-1, 2, 4-triazole (3-पर), और एक्स की उपस्थिति में नीली कालोनियों के रूप में visualized-gal । क्योंकि शक्तिशाली खमीर Gal4 विज्ञापन का प्रयोग किया जाता है, Y1H परख transcriptional उत्प्रेरक के रूप में के रूप में अच्छी तरह से दमन शामिल बातचीत का पता लगा सकते हैं । इसके अलावा, यह देखते हुए कि TF-शिकार एक मजबूत खमीर प्रमोटर (ADH1) से व्यक्त कर रहे हैं, बातचीत भी TFs कि कम अंतर्जात अभिव्यक्ति का स्तर है, जो11,12चिप से पता लगाने के लिए चुनौती दे रहे है के लिए पता लगाया जा सकता है ।
Y1H परख प्रदर्शन के लिए सबसे प्रकाशित प्रोटोकॉल tf शुरू करने के आधार पर कर रहे हैं-खमीर डीएनए में शिकार—के लिए चयन द्वारा पीछा किया, कॉलोनी उठा, और अनुक्रमण से बातचीत tf, या द्वारा की पहचान के बाद परित-शिकार पुस्तकालयों को बदलने से चारा उपभेदों व्यक्तिगत क्लोन8,9बदलने । ये समय लेने वाले प्रोटोकॉल हैं, डीएनए दृश्यों की संख्या सीमित है कि शोधकर्ता के प्रति परीक्षण किया जा सकता है । Y1H परख के एक हाल ही में सुधार, कहा जाता है बढ़ाया Y1H (eY1H), नाटकीय रूप से एक उच्च घनत्व सरणी (HDA) रोबोट मेट खमीर डीएनए के एक संग्रह के साथ चारा उपभेदों का उपयोग करके स्क्रीनिंग का प्रवाह बढ़ गया है प्रत्येक व्यक्त एक अलग TF-शिकार10,13 (फिगर 1C) । इन स्क्रीन एक १,५३६ कॉलोनी के लिए केवल तीन प्लेटों का उपयोग quadruplicate में सबसे मानव TFs परीक्षण की अनुमति प्रारूप काम करते हैं । इसके अलावा, यह देखते हुए कि TF-डीएनए बातचीत एक pairwise तरीके से परीक्षण कर रहे हैं, इस दृष्टिकोण डीएनए के बीच बातचीत की तुलना के लिए अनुमति देता है-चारा (जैसे दो कोडिंग एकल न्यूक्लियोटाइड वेरिएंट के रूप में) और अलग TFs या TF वेरिएंट11,12 के बीच ,14.
eY1H परख का उपयोग करना, हम delineated है सबसे बड़ा मानव और Caenorhabditis एलिगेंस डीएनए-केंद्रित TF-डीएनए बातचीत नेटवर्क करने की तारीख । विशेष रूप से, हम २४६ मानव विकास बढ़ाने और २८३ TFs12के बीच २,२३० बातचीत की पहचान की है । इसके अलावा, हम eY1H परख कार्यरत है को उजागर करने के लिए बदल TF १०९ एकल न्यूक्लियोटाइड कोडिंग जैसे विकासात्मक कुरूपता, कैंसर, और स्नायविक विकारों के रूप में आनुवंशिक रोगों के साथ जुड़े वेरिएंट को बाध्यकारी । हाल ही में, हम eY1H इस्तेमाल के लिए एक नेटवर्क चित्रित २,५७६ सी एलिगेंस जीन प्रवर्तकों और ३६६ TFs11के बीच २१,७१४ बातचीत शामिल है । इस नेटवर्क के लिए सी एलिगेंस TFs के दर्जनों की कार्यात्मक भूमिका को उजागर करने के लिए सहायक था ।
प्रोटोकॉल डीएनए-चारा दाग उत्पंन करने के लिए और पृष्ठभूमि रिपोर्टर गतिविधि के स्तर का मूल्यांकन15,16,17कहीं सूचना दी गई है । यहां, हम एक eY1H पाइपलाइन का वर्णन है कि १,०८६ मानव TFs की एक सरणी के खिलाफ किसी भी मानव जीनोमिक डीएनए क्षेत्र स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । एक बार एक खमीर डीएनए-चारा तनाव उत्पंन होता है और एक TF-शिकार सरणी इसी प्लेटों पर देखा जाता है, पूरे प्रोटोकॉल दो सप्ताह (तालिका 1) में किया जा सकता है । इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल इतना है कि एक एकल शोधकर्ता ६० डीएनए-चारा अनुक्रम एक साथ स्क्रीन कर सकते है समानांतर किया जा सकता है । प्रोटोकॉल का प्रदर्शन करने के लिए, हम दो cytokine जीन CCL15 और IL17F के प्रवर्तकों दिखलाई । इसके अलावा, हम विफल स्क्रीन से परिणाम दिखाने के लिए समस्याओं के प्रकार है कि जब eY1H परख प्रदर्शन और उंहें कैसे निवारण करने के लिए उत्पंन हो सकती है वर्णन ।
Protocol
Representative Results
Discussion
रोबोट eY1H संभोग स्क्रीनिंग दृष्टिकोण यहां वर्णित बहुत प्रवाह को TFs के सेट की पहचान बढ़ जाती है कि ब्याज की एक डीएनए क्षेत्र को बांध, पिछले पुस्तकालय स्क्रीनिंग या सरणी स्क्रीनिंग परिवर्तन के आधार पर दृष?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस कार्य को राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान [R35-GM128625 to J.I.F.B.] द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| 3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC | Sigma | A8056-100G | Competitive inhibitor for products of HIS3 gene |
| Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate | US Biologicals | A0865 | Required for proper yeast growth |
| Agar High Gel Strength – Bacteriological grade | American International Chemical | AGHGUP | Nutritive media for yeast growth |
| Ammonium Sulfate | US Biologicals | A1450 | Nitrogen source in synthetic yeast media |
| D+ Glucose Anhydrous | US Biologicals | G3050 | Required for yeast growth |
| Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base | US Biologicals | D9540-02 | Synthetic complete media required for yeast growth |
| edge Multiparameter pH Meter | Hanna Instruments | HI2020-01 | To measure pH of selective media |
| Flat Toothpicks 750ct | Diamond | To streak yeasts on petridishes | |
| Glass Beads | Walter Stern | 100C | To spreak yeast when making lawns |
| Glycerol ≥99% | Millipore Sigma | G9012-1L | Required to make frozen yeast stocks |
| L-Histidine | US Biologicals | H5100 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Leucine | US Biologicals | L2020-05 | For yeast growth selection in selective media |
| L-Tryptophan | Sigma | T-0254 | For yeast growth selection in selective media |
| N,N-Dimethylformamide | Sigma | 319937-1L | To make X-gal solution |
| Omnipense Elite | Wheaton | W375030-A | For dispensing accurate volumes of media into Singer plates |
| Peptone, Bacteriological | American International Chemical | PEBAUP | Protein source required for yeast growth |
| Petri Dish, 150×15 mm | VWR | 10753-950 | For growing yeast baits for screening |
| PlusPlates | Singer Instruments | PLU-003 | To make rectangular agar plates to use with Singer Robot |
| Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator | ThermoFisher Scientific | PR205745R | To incubate yeast plates at constant temperature |
| RePads 1,536 short | Singer Instruments | REP-005 | To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates |
| RePads 384 short | Singer Instruments | REP-004 | To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format |
| RePads 96 long | Singer Instruments | REP-001 | To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate |
| RePads 96 short | Singer Instruments | REP-002 | To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format |
| Singer HDA RoToR robot | Singer Instruments | For transfering yeast in high-throughput manner | |
| Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS) | Fisher | S318-1 | For adjusting pH of selective media |
| Sodium Phosphate dibasic heptahydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-203402C | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Sodium Phosphate monobasic monohydrate | Santa Cruz Biotechnology | sc-202342B | Required for LacZ reporter activity on X-gal |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | For yeast growth selection in selective media |
| X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside) | Gold Biotechnology | X4281C100 | β-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction |
| Yeast Extract | US Biologicals | Y2010 | Nutritious medium for growth and propagation of yeast |
| Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS | US Biologicals | Y2030 | Required for vigorous yeast growth |
References
- Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. A census of human transcription factors: function, expression and evolution. Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).
- Lambert, S. A., et al. The Human Transcription Factors. Cell. 172 (4), 650-665 (2018).
- Arda, H. E., Walhout, A. J. Gene-centered regulatory networks. Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).
- Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays. Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).
- Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
- Li, J. J., Herskowitz, I. Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system. Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).
- Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System. Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).
- Fuxman Bass, J. I., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions. Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants. Cell. 161 (3), 661-673 (2015).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping. Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).
- Sahni, N., et al. Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders. Cell. 161 (3), 647-660 (2015).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast. Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).
- Deplancke, B., et al. A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network. Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).
- Reece-Hoyes, J. S., et al. Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network. Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).
- Carrasco Pro, S., et al. Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation. Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).
- Whitfield, T. W., et al. Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters. Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters. Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).
- Hens, K., et al. Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements. Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).
- Gubelmann, C., et al. A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks. Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).
- Brady, S. M., et al. A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root. Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).
- Pruneda-Paz, J. L., et al. A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors. Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).
- Burdo, B., et al. The Maize TFome–development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics. The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).
