نموذج انتيرويد الظهارية الإنسان رواية لالتهاب الأمعاء والقولون النّاخر
Summary
انتيرويدس تبرز كنموذج رواية في دراسة الأمراض البشرية. البروتوكول وصف كيفية محاكاة نموذج انتيرويد للبشرية التهاب الأمعاء والقولون النّاخر استخدام العلاج lipopolysaccharide (لبس) من انتيرويدس التي تم إنشاؤها من أنسجة الأطفال حديثي الولادة. انتيرويدس التي تم جمعها تبين التغيرات المثيرة شبيهة بتلك التي شهدتها البشرية التهاب الأمعاء والقولون النّاخر.
Abstract
التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC) مرض مدمر للأطفال حديثي الولادة. تتميز بالتعديلات باثوفيسيولوجيك متعددة في ظهارة الأمعاء البشرية، مما يؤدي إلى زيادة نفاذية الأمعاء، ضعف في الرد، وزاد موت الخلية. على الرغم من أن هناك العديد من النماذج الحيوانية من اللجنة الوطنية للانتخابات، قد تكون الاستجابة للإصابة والتدخلات العلاجية اختلافاً كبيرا بين الأنواع. وعلاوة على ذلك، أنها تمثل تحديا أخلاقيا لدراسة المرض الفيزيولوجيا المرضية أو العوامل العلاجية رواية مباشرة على البشر، لا سيما الأطفال. ولذلك، مرغوب فيه للغاية تطوير نموذج رواية من NEC باستخدام الأنسجة البشرية. انتيرويدس أورجانويدس الأبعاد 3-المستمدة من الخلايا الظهارية المعوية. مثالية لدراسة التفاعلات الفسيولوجية المعقدة، مما يشير إلى خلية، والدفاع المضيف الممرض. في هذه المخطوطة يصف لنا بروتوكول انتيرويدس البشرية تلك الثقافات بعد عزل الخلايا الجذعية المعوية من المرضى الذين يخضعون لاستئصال الأمعاء. الخلايا سرداب تستزرع في الوسائط التي تحتوي على عوامل النمو التي تشجع على التفرقة في الخلية مختلف أنواع الأم من ظهارة الأمعاء البشرية. وتزرع هذه الخلايا في مزيج الاصطناعية، كولاجينوس من البروتينات بمثابة سقالة، محاكاة الغشاء الطابق السفلي خارج الخلوية. نتيجة لذلك وضع انتيرويدس قطبية قمي باسولاتيرال. الإدارة المشارك من lipopolysaccharide (LPS) في وسائل الإعلام يسبب استجابة التهابية في انتيرويدس، مما يؤدي إلى نسيجية، والوراثية، والبروتين التعبير تعديلات مماثلة لتلك التي شهدتها البشرية NEC. نموذج تجريبي من NEC باستخدام الأنسجة البشرية قد توفر منبرا أكثر دقة للمخدرات والعلاج الاختبار قبل التجارب على الإنسان، ونحن نسعى جاهدين للتعرف على علاج لهذا المرض.
Introduction
انتيرويدس البشرية هي السابقين فيفو ثقافة ثلاثي الأبعاد نظام المتولدة من الخلايا الجذعية المعزولة من الخبايا المعوية من عينات الأنسجة المعوية البشرية. كان رائدا هذا النموذج الرائد بها هانز كليفيرس et al في عام 2007 عقب اكتشاف Lgr5 + الخلايا الجذعية في الأقبية الأمعاء الدقيقة في الفئران1. عملهم وأرسى الأساس لإقامة السابقين فيفو ثقافة الظهارية المعوية العديد من أنواع الخلايا التي يمكن أن تكون باساجيد دون التغييرات الوراثية أو الفسيولوجية الهامة2. ومنذ هذا الاكتشاف، استخدمت انتيرويدس كنموذج رواية لدراسة فسيولوجيا الجهاز الهضمي الطبيعي، والفسيولوجيا المرضية للأمراض المعوية مثل مرض التهاب الأمعاء والتفاعلات المضيف الممرض والطب التجديدي2.
الاستخدام من انتيرويدس كالسابقين فيفو نموذج لدراسة الفيزيولوجيا المرضية المعوية مزايا عديدة على تقنيات بديلة. للعقود العديدة الماضية، استخدمت خطوط مخلدة الخلية المستمدة من سرطان الأمعاء ونماذج حيوانية لدراسة علم وظائف الأعضاء المعوية3،،من45. الثقافات خلية واحدة لا تمثل تنوع أنواع الخلايا الموجودة في ظهارة الأمعاء العادية، وبالتالي تفتقر إلى خلية إلى خلية عبر الحديث والجزء-خصوصية في التعبير البروتين، والإشارات، والأمراض الناجمة عن العوامل الممرضة6. الخلايا الجذعية في انتيرويدس تفرق في أهم أنواع الخلايا الظهارية مثل انتيروسيتيس بانته الخلايا والخلايا قدح، والخلايا انتيروندوكريني و أكثر3. معرض قطبية، الاضطلاع بمهام النقل الظهارية، والسماح ل خصوصية المعوية الجزء6. حيث يمكن أن الخص انتيرويدس متعددة أنواع خلايا ظهارة الأمعاء البشرية، فقادرة على التغلب على هذا القيد المعترف بها من الأنظمة المستندة إلى خلايا السرطان. مع مرور الوقت، مشتقات خطوط الخلية هي سوبكلونيد وتتطور إلى إبداء قدر أكبر من التنوع في التعبير والتعريب البروتين3. على العكس من ذلك، يمكن أن باساجيد انتيرويدس دون التغييرات الوراثية أو الفسيولوجية الهامة2. وبالرغم من وجود العديد من النماذج الحيوانية للجنة الوطنية للانتخابات، قد تكون الاستجابة للإصابة والتدخلات العلاجية اختلافاً كبيرا بين الأنواع. ونتيجة لهذه القيود، تفشل العلاجات المستمدة من النماذج الحيوانية 90% الوقت عند اختبارها في التجارب البشرية بسبب الاختلافات في سمية أو كفاءة3. انتيرويدس بمثابة نماذج ما قبل السريرية الواعدة التي يمكن التغلب على أوجه القصور هذه، مما يؤدي إلى فهم أفضل للفيزيولوجيا المرضية المعوية المعقدة، ومن ثم أكثر الابتكارات العلاجية ناجحة وفعالة من حيث التكلفة. وهناك أيضا أدلة حديثة من الأنسجة التي يتم إنشاؤها انتيرويد من العمر ما زالت هامة بيولوجيا7. هذه تفاصيل مهمة خاصة لنموذجنا منذ انتيرويدس تتولد من أنسجة الأطفال حديثي الولادة، وبالتالي الحفاظ على أهميتها الفسيولوجية للمرضى مع اللجنة الوطنية للانتخابات.
الأداة المساعدة انتيرويدس كنماذج لأمراض البشرية تواصل توسيع، أملا في إيجاد علاجات لظروف قاسية وانتشارا. التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC) هو مرض معوي مدمرة الولدان تتميز بنخر الأمعاء وكثيراً ما يؤدي إلى ثقب جدار الأمعاء وتسمم الدم والموت8. سبب الفيزيولوجيا المرضية المعقدة والمتعددة العوامل من NEC، الآلية الدقيقة لهذا المرض قد لا بعد تم تماما توضيح؛ ومع ذلك، زيادة نفاذية الأمعاء كان متورطا بوضوح في عملية المرض8. ونظرا لأن دراسة اللجنة الوطنية للانتخابات والعوامل العلاجية المحتملة تحديا أخلاقيا في البشر، وبخاصة الأطفال، فمن المرغوب فيه جداً الاستفادة من نموذج انتيرويد بيولوجيا ذات صلة من NEC باستخدام الأنسجة البشرية في الأطفال حديثي الولادة. لم انتيرويدس حتى الآن بدور محدود في الدراسة للجنة الوطنية للانتخابات. ويصف هذا البروتوكول استعمال انتيرويدس المستمدة من عينات الأنسجة المعوية البشرية كرواية السابقين فيفو نموذج للدراسة لالتهاب الأمعاء والقولون النّاخر.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذه الرواية السابقين فيفو انتيرويد المعوية البشرية نموذج يخدم كوسيلة مفيدة لدراسة الخلل في جدار الأمعاء في التهاب الأمعاء والقولون النّاخر (NEC). تم تكييف أساليب المعالجة انتيرويد المعروضة هنا من الأعمال السابقة للدكتور حسن ضبابية، ومايكل هيلمراث وفيرتهايم جايسون10،…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
هذا العمل كان يدعمها معهد لمعهد الصحة الوطني لمرض السكري والجهاز الهضمي ومنحة مرض الكلي (K08DK106450) وجائزة جروسفيلد جاي من “الرابطة الأمريكية لجراحي طب الأطفال” إلى C.J.H.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
- Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
- Zachos, N. C., et al. Human Enteroids/Colonoids and Intestinal Organoids Functionally Recapitulate Normal Intestinal Physiology and Pathophysiology. The Journal of Biological Chemistry. 291 (8), 3759-3766 (2016).
- Foulke-Abel, J., et al. Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract. Experimental Biology and Medicine (Maywood). 239 (9), 1124-1134 (2014).
- Hidalgo, I. J., Raub, T. J., Borchardt, R. T. Characterization of the human colon carcinoma cell line (Caco-2) as a model system for intestinal epithelial permeability. Gastroenterology. 96 (3), 736-749 (1989).
- Hilgers, A. R., Conradi, R. A., Burton, P. S. Caco-2 cell monolayers as a model for drug transport across the intestinal mucosa. Pharmaceutical Research. 7 (9), 902-910 (1990).
- In, J. G., et al. Human mini-guts: new insights into intestinal physiology and host-pathogen interactions. Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology. 13 (11), 633-642 (2016).
- Senger, S., et al. Human Fetal-Derived Enterospheres Provide Insights on Intestinal Development and a Novel Model to Study Necrotizing Enterocolitis (NEC). Cell and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 5 (4), 549-568 (2018).
- Moore, S. A., et al. Intestinal barrier dysfunction in human necrotizing enterocolitis. Journal of Pediatric Surgery. 51 (12), 1907-1913 (2016).
- Neal, M. D., et al. A critical role for TLR4 induction of autophagy in the regulation of enterocyte migration and the pathogenesis of necrotizing enterocolitis. The Journal of Immunology. 190 (7), 3541-3551 (2013).
- Lanik, W. E., et al. Breast Milk Enhances Growth of Enteroids: An Ex Vivo Model of Cell Proliferation. Journal of Visualized Experiments. (132), 56921 (2018).
- Mahe, M. M., Sundaram, N., Watson, C. L., Shroyer, N. F., Helmrath, M. A. Establishment of human epithelial enteroids and colonoids from whole tissue and biopsy. Journal of Visualized Experiments. (97), 52483 (2015).
- Uzarski, J. S., Xia, Y., Belmonte, J. C., Wertheim, J. A. New strategies in kidney regeneration and tissue engineering. Current Opinion in Nephrology and Hypertension. 23 (4), 399-405 (2014).
- Leaphart, C. L., et al. A critical role for TLR4 in the pathogenesis of necrotizing enterocolitis by modulating intestinal injury and repair. The Journal of Immunology. 179 (7), 4808-4820 (2007).
- Neal, M. D., et al. Enterocyte TLR4 mediates phagocytosis and translocation of bacteria across the intestinal barrier. The Journal of Immunology. 176 (5), 3070-3079 (2006).
- Sodhi, C. P., et al. Intestinal epithelial Toll-like receptor 4 regulates goblet cell development and is required for necrotizing enterocolitis in mice. Gastroenterology. 143 (3), 708-718 (2012).
- Koo, B. K., et al. Controlled gene expression in primary Lgr5 organoid cultures. Nature Methods. 9 (1), 81-83 (2011).
