Un nuovo modello Enteroid epiteliali umane di enterocolite necrotizzantesi
Summary
Enteroids stanno emergendo come un modello di romanzo nello studio della malattia umana. Il protocollo descrive come simulare un modello enteroid di enterocolite necrotizzante umano mediante trattamento di lipopolisaccaride (LPS) di enteroids generato dal tessuto neonatale. Enteroids raccolti dimostrano cambiamenti infiammatori simili a quelli osservati nella enterocolite necrotizzante umana.
Abstract
Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante degli infanti neonati. Esso è caratterizzato dalle alterazioni patofisiologiche multiple nell’epitelio intestinale umano, che porta ad aumento della permeabilità intestinale, alterato restituzione ed ha aumentato la morte delle cellule. Anche se ci sono numerosi modelli animali di NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. Inoltre, è eticamente impegnativo per studiare la fisiopatologia della malattia o nuovi agenti terapeutici direttamente nei soggetti umani, soprattutto bambini. Di conseguenza, è altamente desiderabile per sviluppare un nuovo modello di NEC utilizzando tessuto umano. Enteroids sono 3-dimensionale organoids derivato dalle cellule epiteliali intestinali. Sono ideali per lo studio delle complesse interazioni fisiologiche, segnalazione delle cellule e della difesa ospite-patogeno. In questo manoscritto Descriviamo un protocollo che culture umane enteroids dopo aver isolato cellule staminali intestinali da pazienti sottoposti a resezione delle viscere. Le cellule della cripta sono coltivate in media che contengono fattori di crescita che favoriscono la differenziazione nel vari nativo di tipi delle cellule dell’epitelio intestinale umano. Queste cellule sono coltivate in un mix sintetico, collageno delle proteine che fungono da un’impalcatura, che imita l’extra-cellulare della membrana dello scantinato. Di conseguenza, enteroids sviluppare apicale basolaterale polarità. La somministrazione concomitante di lipopolisaccaride (LPS) in media provoca una risposta infiammatoria nel enteroids, che portano a istologica, genetica e le alterazioni di espressione della proteina simili a quelli osservati in NEC umano. Un modello sperimentale di NEC utilizzando tessuto umano può fornire una piattaforma più accurata per droga e del trattamento di prova prima della sperimentazione umana, come ci sforziamo di identificare una cura per questa malattia.
Introduction
Enteroids umana sono un ex vivo sistema di coltura 3-dimensionale generato da cellule staminali isolate da cripte intestinali dei campioni di tessuto intestinale umano. Questo modello innovativo è stato introdotto da Hans Clevers et nel 2007 in seguito alla scoperta di Lgr5 + cellule staminali presso le cripte di piccolo intestino in topi1. Loro lavoro gettato le basi per l’istituzione di un ex vivo cultura epiteliale intestinale di più tipi di cellule che potrebbero essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici2. Dopo questa scoperta, enteroids sono stati utilizzati come un nuovo modello per studiare la normale fisiologia digestiva e fisiopatologia delle malattie intestinali come la malattia di viscere infiammatoria, interazioni ospite-patogeno e medicina rigenerativa2.
L’uso di enteroids come un ex vivo modello per lo studio della fisiopatologia intestinale ha diversi vantaggi rispetto a tecniche alternative. Per i parecchi decenni passati, modelli animali e linee cellulari derivate da cancro intestinale immortalate sono state utilizzate per studiare la fisiologia intestinale3,4,5. Cella singola culture non rappresentano la diversità dei tipi di cellule presenti nell’epitelio intestinale normale, quindi mancano le celle cross-talk e segmento-specificità nell’espressione della proteina, segnalazione e malattia indotta da agente patogeno6. Cellule staminali in enteroids differenziarsi nei principali tipi di cellule epiteliali quali enterociti, cellule di Paneth, cellule caliciformi, cellule enteroendocrine e altre3. Polarità per mostre, svolgono funzioni di trasporto epiteliale e consentire per segmento intestinale specificità6. Poiché enteroids può ricapitolare i più tipi di cellule dell’epitelio intestinale umano, sono in grado di superare questa limitazione riconosciuta di sistemi basati su cellule di cancro. Nel corso del tempo, derivati di linee cellulari sono subcloned ed evolvono per presentano una maggiore diversità di espressione e la localizzazione della proteina3. Al contrario, enteroids possono essere attraversate senza significativi cambiamenti genetici o fisiologici2. Sebbene esistano numerosi modelli animali per NEC, risposta alla lesione ed interventi terapeutici può essere altamente variabile tra specie. A causa di queste limitazioni, terapie derivate da modelli animali non riuscire il 90% del tempo quando provati nelle prove umane a causa di differenze nella tossicità o l’efficacia3. Enteroids servire come modelli pre-clinici promettenti che possono colmare queste lacune, che conduce ad una migliore comprensione della patofisiologia intestinale complesso e quindi più redditizia e di successo innovazioni terapeutiche. C’è anche la prova recente che l’età del tessuto che un enteroid viene generato da rimane biologicamente importante7. Questo è un dettaglio particolarmente importante per il nostro modello poiché enteroids vengono generati dal tessuto neonatale, mantenendo quindi rilevanza fisiologica ai pazienti con NEC.
L’utilità di enteroids come modelli di malattie umane continua ad espandersi, nella speranza di trovare cure per le condizioni gravi e pervasive. Enterocolite necrotizzante (NEC) è una malattia devastante intestinale dei neonati caratterizzata da necrosi intestinale e frequentemente conduce alla perforazione della parete delle viscere, setticemia e morte8. A causa di patofisiologia complessa e multifattoriale di NEC, il meccanismo esatto della malattia non è ancora stato completamente delucidato; Tuttavia, la permeabilità intestinale aumentata è stata chiaramente implicata nella malattia processo8. Dato che lo studio del NEC e potenziali agenti terapeutici è eticamente impegnativo nei soggetti umani, soprattutto bambini, è altamente auspicabile per utilizzare un modello di enteroid biologicamente rilevanti del NEC utilizzando tessuto umano neonatale. Finora, enteroids hanno un ruolo limitato nello studio del NEC. Questo protocollo descrive l’uso di enteroids derivati da campioni di tessuto intestinale umano come un romanzo ex vivo modello per lo studio di enterocolite necrotizzantesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo romanzo ex vivo enteroid intestinale umano modello serve come un metodo utile per lo studio della disfunzione della barriera intestinale in enterocolite necrotizzante (NEC). I metodi di elaborazione di enteroid qui presentati sono stati adattati dal precedente lavoro della d. ssa Misty Good, Michael Helmrath e Jason Wertheim10,11,12.
Dettagli che circondano l’intera collezione dei tessuti e la …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato supportato dall’Istituto di salute Istituto nazionale di diabete e digestivo e rene malattia Grant (K08DK106450) e il premio Jay Grosfeld associazione chirurgica pediatrica americana-C.J.H.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
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