Un modelo de enteroide epitelial humano novedoso de Enterocolitis necrosante
Summary
Enteroids se perfila como un modelo novedoso en el estudio de las enfermedades humanas. El protocolo describe cómo simular un modelo enteroide de enterocolitis necrosante humana tratamiento de lipopolisacárido (LPS) de enteroids generados a partir de tejido neonatal. Enteroids recogidos demuestran cambios inflamatorios similares a los observados en humana enterocolitis necrotizante.
Abstract
La enterocolitis necrotizante (NEC) es una enfermedad devastadora de los recién nacidos. Se caracteriza por múltiples alteraciones fisiopatológicas en el epitelio intestinal humano, conduce a aumento de la permeabilidad intestinal, alteración de restitución y aumenta la muerte celular. Aunque existen numerosos modelos animales de NEC, respuesta a la lesión y las intervenciones terapéuticas puede ser altamente variable entre especies. Además, es éticamente desafiante para el estudio de la fisiopatología de la enfermedad o nuevos agentes terapéuticos directamente en seres humanos, especialmente los niños. Por lo tanto, es altamente deseable para el desarrollo de un modelo novedoso de NEC con tejido humano. Enteroids son 3 dimensiones organoides derivados de las células epiteliales intestinales. Son ideales para el estudio de las interacciones fisiológicas complejas, señalización celular y defensa huésped-patógeno. En este manuscrito se describe un protocolo enteroids humana las culturas después de aislar las células madre intestinales de pacientes sometidos a resección intestinal. Las células de la cripta se cultivan en medios que contienen factores de crecimiento que estimulan la diferenciación en el varios nativo de tipos celulares del epitelio intestinal humano. Estas células crecen en una mezcla sintética, colágeno de proteínas que sirven como andamio, mímico la membrana basal extracelular. Como resultado, enteroids desarrollar polaridad apical basolateral. La administración concomitante de lipopolisacárido (LPS) en medios de comunicación provoca una respuesta inflamatoria en enteroids, que conduce a histologic, genética y alteraciones de la expresión de proteína similares a ésos vistos en NEC humana. Un modelo experimental de NEC utilizando tejido humano puede proporcionar una plataforma más precisa de drogas y tratamiento de prueba antes de los ensayos en humanos, como nos esforzamos por identificar una cura para esta enfermedad.
Introduction
Enteroids humanas son un ex vivo sistema de 3 dimensiones de la cultura generado a partir de células madre aisladas de criptas intestinales de las muestras de tejido intestinal humano. Este modelo innovador fue pionero por Hans Clevers et en 2007 tras el descubrimiento de Lgr5 + células en las criptas del intestino en ratones1. Su trabajo sentó las bases para el establecimiento de un ex vivo cultura epiteliales intestinales múltiples tipos de células que pueden ser pasados sin cambios genéticos o fisiológicos significativos2. Desde este descubrimiento, enteroids se han utilizado como un modelo novedoso para el estudio de la fisiología digestiva normal y la fisiopatología de enfermedades intestinales como la enfermedad inflamatoria intestinal, interacciones huésped-patógeno y medicina regenerativa2.
El uso de enteroids como una ex modelo vivo para el estudio de la fisiopatología intestinal tiene varias ventajas sobre técnicas alternativas. Durante las últimas décadas, se han utilizado para estudiar la fisiología intestinal3,4,5modelos animales y líneas celulares inmortalizadas de derivados del cáncer intestinal. Cultivos celulares solo no representan la diversidad de tipos de células presentes en el epitelio intestinal normal, careciendo de tal modo Charla cruzada de célula a célula y segmento-especificidad de expresión de la proteína, la señalización y la enfermedad inducida por el patógeno6. Las células madre en enteroids se diferencian en los principales tipos de células epiteliales como enterocitos, células de Paneth, células caliciformes, células enteroendocrinas y más3. Presentan polaridad, realizar funciones de transporte epiteliales y permiten de especificidad del segmento intestinal6. Desde enteroids puede recapitular los múltiples tipos de células de epitelio intestinal humano, son capaces de superar esta limitación reconocida de sistemas basadas en células de cáncer. Con el tiempo, derivados de líneas celulares se subcloned y evolucionan para exhibir una mayor diversidad en la expresión y localización de proteínas3. Por el contrario, enteroids pueden ser pasados sin cambios genéticos o fisiológicos significativos2. Aunque existen numerosos modelos animales para NEC, respuesta a la lesión y las intervenciones terapéuticas puede ser altamente variable entre especies. Como resultado de estas limitaciones, terapias derivadas de modelos animales fallan el 90% del tiempo en los ensayos en humanos debido a diferencias en la toxicidad y eficacia3. Enteroids servir como modelos preclínicos prometedores que pueden superar estas deficiencias conducen a una mejor comprensión de la compleja Fisiopatología intestinal y por lo tanto, más exitosas y rentables de las innovaciones terapéuticas. También hay evidencias recientes que la edad del tejido que un enteroide se genera a partir sigue siendo biológicamente importantes7. Esto es un detalle especialmente importante para nuestro modelo ya enteroids se generan a partir del tejido neonatal, manteniendo así relevancia fisiológica en pacientes con NEC.
La utilidad de enteroids como modelos de enfermedades humanas continúa expandiéndose, con la esperanza de encontrar curas para condiciones severas y penetrantes. Enterocolitis necrotizante (NEC) es una enfermedad intestinal devastadora de los recién nacidos caracterizada por necrosis intestinal y con frecuencia conduce a la perforación de la pared intestinal, septicemia y muerte8. Debido a la fisiopatología compleja y multifactorial de la NEC, el mecanismo exacto de la enfermedad ha no aún se han aclarado completamente; sin embargo, el aumento de la permeabilidad intestinal se ha implicado claramente en el proceso de la enfermedad8. Dado que el estudio de posibles agentes terapéuticos y NEC es éticamente desafiante en seres humanos, especialmente los niños, es muy conveniente utilizar un modelo biológicamente relevantes enteroide de NEC utilizando tejido humano neonatal. Hasta el momento, enteroids tienen un papel limitado en el estudio de NEC. Este protocolo describe el uso de enteroids derivada de las muestras de tejido intestinal humano como una novela de la ex modelo vivo para el estudio de la enterocolitis necrosante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esta novela ex vivo enteroide intestinal humano modelo sirve como un método útil para el estudio de la disfunción de la barrera intestinal en la enterocolitis (NEC) necrotizante. Los métodos de procesamiento enteroide presentados aquí fueron adaptados de la obra anterior de los Drs. Misty Good, Michael Helmrath y Jason Wertheim10,11,12.
Detalles que rodean toda la colección de tejidos y el tiemp…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Instituto de Salud Instituto Nacional de Diabetes y el Jay Grosfeld Premio de la Asociación Americana de cirugía pediátrica C.J.H., digestivo y riñón enfermedad Grant (K08DK106450)
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
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