Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante
Summary
Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.
Abstract
L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice chez le nouveau-né. Il se caractérise par plusieurs altérations physiopathologiques de l’épithélium intestinal humain, conduisant à une augmentation de la perméabilité intestinale, avec facultés affaiblies de restitution et a augmenté la mort cellulaire. Bien qu’il existe de nombreux modèles animaux de l’entérocolite Nécrosante, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En outre, il est éthiquement difficile d’étudier la physiopathologie de la maladie ou de nouveaux agents thérapeutiques directement sur des sujets humains, en particulier les enfants. Par conséquent, il est hautement souhaitable d’élaborer un nouveau modèle de NEC à l’aide de tissus humains. Enteroids y a 3 dimensions organoïdes dérivées de cellules épithéliales intestinales. Elles sont idéales pour l’étude des interactions physiologiques complexes, la signalisation cellulaire et de la défense de l’hôte-pathogène. Dans ce manuscrit, les auteurs décrivent un protocole cette enteroids humaine de cultures après isoler des cellules souches intestinales des patients devant subir une résection de l’intestin. Les cellules des cryptes sont cultivées dans des milieux contenant des facteurs de croissance favorisant la différenciation dans le natif de types différentes cellules de l’épithélium intestinal humain. Ces cellules sont cultivés dans un mélange synthétique, collagène de protéines qui servent comme un échafaudage, imitant la membrane basale extra-cellulaires. Ainsi, enteroids développer apicale-basolatérale polarité. L’administration concomitante du lipopolysaccharide (LPS) dans les médias provoque une réaction inflammatoire dans l’enteroids, menant à histologique, génétiques et altérations d’expression de protéines similaires à celles observées chez les humain NEC. Un modèle expérimental de NEC à l’aide de tissus humains peut fournir une plateforme plus précise pour les médicaments et traitements tests avant les essais chez l’homme, nous nous efforçons d’identifier un remède pour cette maladie.
Introduction
Enteroids humains sont un ex vivo système de culture 3 dimensions généré à partir de cellules souches isolées de cryptes intestinales des échantillons de tissu intestinal humain. Ce modèle révolutionnaire a été lancé par Hans Clevers et coll. en 2007 suite à la découverte de Lgr5 + des cellules souches dans les cryptes de l’intestin grêle dans la souris1. Leur travail a jeté les bases pour l’établissement d’un ex vivo la culture épithéliale intestinale de plusieurs types de cellules qui pourraient être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Depuis cette découverte, enteroids ont servi comme un nouveau modèle pour étudier la physiologie digestive normale et la physiopathologie des maladies intestinales telles que les maladies inflammatoires de l’intestin, interactions hôte-pathogène et la médecine régénérative,2.
L’utilisation d’enteroids comme un ex vivo de modèle pour l’étude de la physiopathologie intestinale présente plusieurs avantages sur les autres techniques. Pour les dernières décennies, les modèles animaux et lignées cellulaires dérivées de cancer intestinal immortalisées ont servi à étudier la physiologie intestinale3,4,5. Single-cell cultures ne représentent pas la diversité des types de cellules présents dans l’épithélium intestinal normal, manquant ainsi une cellule à la diaphonie et segment-spécificité dans l’expression de la protéine, la signalisation et la maladie induite par l’agent pathogène6. Enteroids les cellules souches se différencient en les principaux types de cellules épithéliales comme les entérocytes, cellules de Paneth, cellules caliciformes, cellules entéroendocrines et plus3. Ils présentent la polarité, assure les fonctions de transport épithélial et permettant un segment intestinal spécificité6. Étant donné qu’enteroids peut récapituler les multiples types de cellules de l’épithélium intestinal humain, ils sont capables de surmonter cette limitation reconnue des systèmes basés sur les cellules de cancer. Au fil du temps, dérivés de lignées cellulaires sont sous-cloné et d’évoluent pour exposer une plus grande diversité d’expression et la localisation protéine3. Au contraire, les enteroids peuvent être repiquées sans modifications génétiques ou physiologiques importantes2. Bien qu’il existent de nombreux modèles animaux pour NEC, réponse à des blessures et des interventions thérapeutiques peut-être être très variable entre les espèces. En raison de ces limitations, produits thérapeutiques dérivés de modèles animaux ne parviennent pas à 90 % du temps lorsqu’il est testé dans des essais humains en raison de différences dans la toxicité ou l’efficacité3. Enteroids servir de modèles précliniques prometteurs qui peuvent surmonter ces insuffisances, conduisant à une meilleure compréhension de la physiopathologie intestinale complexe et donc plus efficace et rentables des innovations thérapeutiques. Il y a aussi des éléments de preuve récente que l’âge des tissus qui ont un enteroid est généré reste biologiquement importants7. Il s’agit d’un détail particulièrement important pour notre modèle puisque les enteroids sont générés à partir du tissu néonatal, ainsi maintenir la pertinence physiologique aux patients avec NEC.
L’utilité d’enteroids comme modèles de maladies humaines continue à se développer, dans l’espoir de trouver des remèdes aux conditions graves et profondes. L’entérocolite nécrosante (NEC) est une maladie dévastatrice intestinale des nouveaux-nés que se caractérise par une nécrose intestinale et fréquemment conduit à la perforation de la paroi intestinale, septicémie et mort8. En raison de la physiopathologie complexe et multifactorielle de l’entérocolite Nécrosante, le mécanisme exact de la maladie n’a pas encore été complètement élucidé ; Cependant, une augmentation de la perméabilité intestinale a été clairement impliquée dans le processus de la maladie8. Étant donné que l’étude de NEC et agents thérapeutiques potentiels est éthiquement difficile sur des sujets humains, en particulier les enfants, il est hautement souhaitable d’utiliser un modèle d’enteroid biologiquement pertinente de NEC à l’aide de tissus humains néonatale. Jusqu’ici, les enteroids ont un rôle limité dans l’étude de l’entérocolite Nécrosante. Ce protocole décrit l’utilisation d’enteroids provenant d’échantillons de tissu intestinal humain comme un roman ex vivo de modèle pour l’étude de l’entérocolite nécrosante.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce roman ex vivo enteroid intestinal humain modèle sert d’une méthode utile pour l’étude du dysfonctionnement de la barrière intestinale dans l’entérocolite nécrosante (NEC). Les méthodes de traitement enteroid présentées ici ont été adaptés des travaux précédent du DRS Misty Good, Michael Helmrath et Jason Wertheim10,11,12.
Détails qui entoure l’ensemble prélèvement tissulair…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institute of Health Institute, de diabète et Digestive et rénale maladie Grant (K08DK106450), le Jay Grosfeld le prix de l’Association américaine de chirurgie pédiatrique de C.J.H.
Materials
| 4% Paraformaldehyde | ThermoFisher | AAJ19943K2 | |
| A-83 | R&D Tocris | 2939/10 | |
| Amphotericin B | ThermoFisher | 15290026 | |
| B-27 supplement minus Vitamin A | ThermoFisher | 17504-044 | |
| Basement Membrane Matrix (Matrigel) | Corning | CB-40230C | |
| DMEM/F-12 | ThermoFisher | MT-16-405-CV | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher | 11-965-118 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14190-144 | |
| Epidermal Growth Factor (EGF) | Sigma | E9644-.2MG | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma | EDS-500G | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gemini Bio-Pro | 100-125 | |
| Gentamicin | Sigma | G5013-1G | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | ThermoFisher | 35050-061 | |
| Insulin | Sigma | I9278-5mL | |
| [leu] 15-gastrin 1 | Sigma | G9145-.1MG | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma | L2630-25MG | |
| N-2 supplement | ThermoFisher | 17502-048 | |
| N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethane sulfonic acid (HEPES) | ThermoFisher | 15630-080 | |
| N-Acetylcysteine | Sigma | A9165-5G | |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | |
| Noggin | R&D Systems INC | 6057-NG/CF | |
| Penicillin-Streptomycin | ThermoFisher | 15140-148 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma | P5368-5X10PAK | |
| RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 11875093 | |
| R-Spondin | PEPROTECH INC | 120-38 | |
| SB202190 | Sigma | S7067-5MG | |
| Tissue Processing Gel (Histogel) | ThermoFisher | 22-110-678 | |
| Wnt3a | R&D Systems INC | 5036-WN-010 | |
| Y-27632 | Sigma | Y0503-1MG |
References
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