Repeatable पैटर्न संरचनाओं के लिए एक संकर जेल घन डिवाइस में प्रारंभिक 3 डी सेल क्लस्टर नियंत्रण
Summary
हम एक repeatable पैटर्न गठन प्राप्त करने के लिए एक 3 डी extracellular मैट्रिक्स में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए एक प्रक्रिया मौजूद है । ऊतक पैटर्न के गठन के लिए बहु-दिशात्मक इमेजिंग को प्राप्त करने के लिए दो विभिन्न hydrogels युक्त एक घन डिवाइस कार्यरत है ।
Abstract
इन विट्रो 3D संस्कृतियों के महत्व को कोशिका/ऊतक संवर्धन में काफी बल दिया जाता है । हालांकि, प्रयोगात्मक repeatability की कमी इसके प्रतिबंधों में से एक है । पैटर्न के गठन के कुछ repeatable परिणाम उत्पादन स्वयं संगठन अंतर्निहित तंत्र के विश्लेषण को कमजोर करता है । प्रारंभिक संस्कृति की स्थिति में भिन्नता को कम करने, जैसे कोशिका घनत्व और बाह्य मैट्रिक्स (ECM) में वितरण, एक 3 डी संस्कृति के repeatability को बढ़ाने के लिए महत्वपूर्ण है. इस अनुच्छेद में, हम एक 3 डी extracellular मैट्रिक्स में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए अत्यधिक repeatable पैटर्न संरचनाओं को प्राप्त करने के लिए एक सरल लेकिन मजबूत प्रक्रिया का प्रदर्शन । एक वांछित आकार के साथ एक माइक्रोओल्ड photolithography या मशीनिंग प्रक्रिया का उपयोग करके निर्मित किया गया था, और यह एक संकर जेल घन में निहित ECM में एक 3 डी जेब का गठन (HGC). उच्च केंद्रित कोशिकाओं तो जेब में इंजेक्शन थे कि सेल क्लस्टर आकार गढ़े मोल्ड आकार के साथ मिलान किया । कार्यरत HGC बहु अपने रोटेशन है, जो उच्च संकल्प इमेजिंग सक्षम और पूरे ऊतक संरचना का कब्जा भले ही एक कम इज़ाफ़ा लेंस इस्तेमाल किया गया था द्वारा दिशात्मक स्कैनिंग की अनुमति दी । सामान्य मानव ब्रोनियल उपकला कोशिकाओं की कार्यप्रणाली को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया.
Introduction
एक 3 डी संस्कृति है, जो बेहतर जैविक वातावरण mimics से एक 2d संस्कृति का महत्व है, काफी सेल में बल दिया/ कोशिकाओं और extracellular मैट्रिक्स (ecm) के बीच बातचीत के लिए महत्वपूर्ण cues प्रदान करता है संरचनाविकास4,5. कई ऊतक संरचनाओं केवल 3 डी वातावरण के तहत उभर सकते हैं, जैसे तह प्रक्रिया6,7,8अंतर्वलन, और ट्यूबलर गठन9,10. हालांकि, कई कठिनाइयों एक डिश पर 2D प्रयोगों से 3 डी प्रयोगों के लिए स्थानांतरण से शोधकर्ताओं को रोकने के । 3 डी प्रयोगों में प्रमुख कठिनाइयों में से एक इमेजिंग 3D नमूनों का मुद्दा है । समतलाकार प्रयोगों के साथ तुलना में, उपयुक्त 3 डी छवियों का अधिग्रहण अभी भी कई मामलों में चुनौतीपूर्ण है । विशेष रूप से, एक उपयुक्त 3 डी छवि प्राप्त करना एक मुश्किल काम है जब नमूना आकार कम-आवर्धन लेंस की बड़ी फोकल गहराई के कारण मिलीमीटर रेंज तक पहुंचता है । उदाहरण के लिए, फोकल गहराई ५० μm से अधिक तक पहुंचती है जब एक 10x आवर्धन लेंस का प्रयोग किया जाता है जबकि एकल कोशिका का आकार सामान्य रूप से 10 μm से कम होता है । इमेजिंग गुणवत्ता बढ़ाने के लिए, उच्च प्रौद्योगिकी माइक्रोस्कोपी सिस्टम विकसित किया जा रहा है (जैसे, दो photon माइक्रोस्कोपी11 और प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी प्रणाली12), लेकिन उनकी उपलब्धता उनके महंगे मूल्य के कारण सीमित है । एक विकल्प के रूप में, हम पहले एक संकर जेल घन (HGC)13डिवाइस विकसित की है । डिवाइस hydrogels के दो प्रकार के होते हैं: एक समर्थन जेल और ऐसे कोलेजन या एक संस्कृति जेल के रूप में matrigel के रूप में एक ecm के रूप में ऐगेरोस । hgc हमें संवर्धन के दौरान नमूना इकट्ठा करने के लिए और घन घुमाएगी बहु-दिशात्मक इमेजिंग, जो फोकल गहराई समस्या14पते को प्राप्त करने की अनुमति देता है ।
3 डी प्रयोगों में एक और कठिनाई उनके कम repeatability 3 डी वातावरण के गरीब नियंत्रणीयता के कारण है । एक प्लास्टिक की डिश पर एक समतलता संस्कृति के विपरीत, प्रारंभिक संस्कृति की स्थिति में बदलाव आसानी से एक नरम सामग्री से घिरा हुआ एक 3 डी अंतरिक्ष में होते हैं । प्रयोगात्मक परिणामों में एक महत्वपूर्ण भिंनता निंनलिखित विश्लेषण बिगड़ती है और अंतर्निहित तंत्र मास्क । कई इंजीनियरिंग प्रौद्योगिकियों स्थानिक15,16, फाइबर बुनाई17के रूप में एकल कोशिकाओं, संरेखित करने के लिए विकसित किया गया है, और मचान18, लेकिन वे जटिल preprocessing की आवश्यकता होती है या विशेष रूप से उपकरण तैयार किया । इसके विपरीत, हम एक HGC19में 3 डी सेल संरेखण को प्राप्त करने के लिए एक पद्धति विकसित की है ।
इस प्रोटोकॉल में, हम एक HGC में 3 डी प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार को नियंत्रित करने के लिए आमतौर पर इस्तेमाल किया उपकरणों के साथ एक सरल प्रक्रिया सचित्र । सबसे पहले, HGC के निर्माण की प्रक्रिया का प्रदर्शन किया गया । फिर, एक ECM में एक मनमाने ढंग से आकार के साथ एक जेब का उत्पादन करने के लिए HGC में रखा गया था, फोटोनोग्राफी या मशीनिंग प्रक्रिया द्वारा निर्मित माइक्रोबूल्ड्स । बाद में, अत्यधिक घने कोशिकाओं के बाद केंद्रापसारक पॉकेट में इंजेक्शन के लिए HGC में प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार नियंत्रित किया गया । ठीक से नियंत्रित सेल क्लस्टर HGC के कारण कई दिशाओं से imaged हो सकता है । सामान्य मानव ब्रोंशियल उपकला (NHBE) कोशिकाओं इमेजिंग गुणवत्ता बढ़ाने के लिए कई दिशाओं से प्रारंभिक सेल क्लस्टर आकार और शाखाओं की इमेजिंग के नियंत्रण को प्रदर्शित करने के लिए इस्तेमाल किया गया ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस पत्र में प्रस्तुत विधि सरल है और उच्च प्रौद्योगिकी उपकरणों के बिना किया जा सकता है । समवर्ती, हाइड्रोजेल के 3 डी अंतरिक्ष में एक सटीक सेल क्लस्टर आकार नियंत्रण परिणाम प्राप्त किया जा सकता है । प्रारं…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम आर्थिक रूप से JSPS KAKENHI (18H04765) और कार्यक्रम के कार्यकाल ट्रैक प्रणाली, MEXT, जापान के प्रसार के द्वारा समर्थित किया गया ।
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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