반복 패턴 형성을 위한 하이브리드 젤 큐브 장치에 초기 3D 셀 클러스터 제어

Summary

우리는 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 절차를 제시. 포함 하는 두 개의 다른 hydrogels 입방 장치 다 방향 영상 조직 패턴 형성에 대 한 달성 하기 위해 채택 된다.

Abstract

생체 외에서 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화에 상당히 강조 했다. 그러나, 실험적인 반복성의 부족의 제한 중 하나입니다. 패턴 형성의 몇 반복 결과 악화 자기 조직 기본 메커니즘의 분석. 셀 밀도 등은 세포 외 기질 (ECM)에 배포 초기 문화 조건에 변화를 줄이는 것은 3D 문화의 반복성을 향상 시키기 위해 중요 한. 이 문서에서는 높은 반복 패턴 형성을 얻기 위해 3 차원 기질에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 간단 하지만 강력한 절차를 설명 합니다. 원하는 모양으로 micromold 사진 평판 또는 머시닝 프로세스를 사용 하 여 조립 되었다 그리고 그것은 하이브리드 젤 큐브 (HGC)에 포함 된 ECM에서 3D 포켓을 형성. 셀 클러스터 모양이 조작된 형 모양으로 일치 되도록 농축된 셀 했다 다음 주머니에 주입 됩니다. 고용된 HGC 허용 다 방향 회전, 저 배율 렌즈를 사용 하더라도 고해상도 이미징 및 전체 조직 구조의 캡처를 사용 하도록 설정 하 여 검색. 정상적인 인간의 기관지 상피 세포는 방법론을 설명 하기 위해 사용 되었다.

Introduction

2D 문화 보다 더 나은 생물 환경 모방, 3D 문화의 중요성은 세포/조직 문화^1,2,3에 상당히 강조 했다. 세포와 세포 외 기질 (ECM) 간의 상호 작용 morphogenesis^4,5에 관한 중요 한 단서를 제공합니다. 많은 조직 형성 접는 과정^6,7, invagination⁸, 관 형성^9,10등 3D 환경 아래 에서만 나타날 수 있습니다. 그러나, 수많은 어려움 2D 실험에서 3D 실험 접시에 이동에서 연구원을 방지 합니다. 3D 실험에 큰 어려움 중 하나는 이미징 3D 샘플 문제입니다. 평면 실험에 비해, 적절 한 3D 이미지의 수집 아직도 많은 경우에 도전 이다. 특히, 적절 한 3D 이미지를 얻는 때 어려운 작업 샘플 크기 때문에 낮은 확대 렌즈의 큰 초점 깊이 밀리미터 범위에 도달. 단일 셀의 크기는 일반적으로 10 µ m 10 배 확대 렌즈를 사용할 때 예를 들어 초점 깊이 50 µ m에 도달 합니다. 이미지 품질을 향상 시키기 위해, 높은-기술 현미경 시스템 개발 되 고 있다 (예를 들어, 두 광자 현미경¹¹ 및 빛 시트 현미경 시스템¹²), 하지만 그들의 가용성 때문에 그들의 비싼 가격 제한 됩니다. 대신, 우리는 이전 하이브리드 젤 큐브 (HGC) 장치¹³를 개발 했습니다. 장치 hydrogels 두 가지 유형의 구성: 지원 젤과 콜라겐 등 ECM 또는 문화 젤으로 Matrigel agarose. HGC는 경작 하는 동안 샘플을 수집 하 고¹⁴의 초점 깊이 문제 해결 하는 다 방향 영상을 달성 하기 위해 큐브를 회전 수 있습니다.

3D 실험에서 또 다른 어려움은 그들의 낮은 반복성 3D 환경의 가난한 제어력 때문 이다. 플라스틱 접시에 평면 문화와 달리 초기 문화 조건에 변화는 쉽게 부드러운 소재에 의해 포위 하는 3D 공간에서 발생 합니다. 실험 결과에 중요 한 변화 악화 다음 분석 하 고 근본적인 메커니즘을 마스크. 많은 공학 기술 공간 bioprinting^15,16,¹⁷과 비 계¹⁸, 섬유와 같은 단일 셀에 맞게 개발 되었습니다 하지만 그들은 복잡 한 전처리 필요 하거나 특별히 설계 된 장비입니다. 반면, 우리 HGC¹⁹에서 3D 셀 맞춤을 달성 하기 위한 방법론을 개발 했습니다.

이 프로토콜에서 우리는 HGC에 3D 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하기 위한 일반적으로 사용된 하는 장비와 간단한 절차 설명. 첫째, HGC는의 제작 과정을 시연 했다. 다음, 사진 평판 또는 가공 공정에 의해 조작 하는 micromolds는 ECM에서 임의의 모양 가진 주머니 생산 HGC에 배치 했다. 그 후, 원심 분리 후 고집적 세포는 HGC에서 초기 셀 클러스터 모양을 제어 하는 주머니에 주입 했다. 정확 하 게 제어 셀 클러스터는 HGC 때문에 여러 방향에서 몇 군데 될 수 있습니다. 정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 세포 이미징 품질 향상을 위한 여러 방향에서 초기 셀 클러스터 모양 제어 및 이미징의 보여 주기 위해 사용 되었다.

Protocol

1입니다. 하이브리드 젤 큐브 장치 제조 폴 리카 보 네이트 (PC) 큐빅 프레임 가공 공정 또는 3D 프린터를 사용 하 여 준비 합니다. PC 프레임의 크기는 샘플의 크기에 따라 달라 집니다. 이 연구에서 우리가 사용 5mm의 프레임 양쪽에 분기 했다 경작 하는 동안 길게 하기에 충분 한 공간. 사전 냉각된 유리 슬라이드 또는 얼음 상자에 다른 부드러운 표면에 PC 프레임을 배치 (< 0 ° C) (<strong…

Representative Results

정상적인 인간의 기관지 상피 (NHBE) 셀 그림된 방법론을 설명 하 고 실린더 모양 및 ECM 환경에서 각각 프리즘 모양 초기 집단 셀 형상을 제어 하 사용 되었다. 단계 대조로 phalloidin 실린더 모양 (그림 4AB)와 (그림 4CD) 프리즘 모양의 얼룩 다 방향 이미징 결과 표시 됩니다. 셀은 ECM 환경에서 원하는 3D 형태?…

Discussion

이 문서에 소개 된 방법은 간단 하 고 높은-기술 장비 없이 수행할 수 있습니다. 동시에, 히드로의 3D 공간에서 정확한 셀 클러스터 모양을 제어 결과 얻을 수 있습니다. 초기 제어 후 셀 만큼 그들은 접시에 교양으로 HGC에서 성장할 수 있다. 다 방향 영상 HGC 어떤 현미경 시스템을 사용 하 여 함께 샘플을 회전 하 여 수행 되 고 크게 이미징 품질을 향상 시킵니다. HGC 프레임 및 micromold에 대 한 자료의…

Materials

12-well-plate	Corning  Inc.	3513
2-Methoxy-1-methylethyl Acetate	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	130-10505	PGMEA, CAS: 108-65-6
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Co.	161-20141	CAS: 30525-89-4
Agarose, low gelling temperature  BioReagent	Sigma-Aldrich	A9414
Alexa fluor 488 phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
AZ1512	Merck
BEGM bullet kit	Lonza	CC-3170	Specialized medium for NHBE cells
Bovine Serum Albumin solution (10 %)	Sigma-Aldrich	A1595
EGM-2 bullet kit	Lonza	CC-3162	Specialized medium for endothelial cells
Lipidure	NOF co.		MPC polymer
Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix	Corning  Inc.	354230
Normal Goat Serum (10%)	Thermo Fisher Scientific	50197Z
Normal human bronchial epithelial cells	Lonza	CC-2541
SILPOT 184 W/C	Dow Corning Co.	3255981	Base resin and catalyst for PDMS
SUEX D300		DJ MicroLaminates, Inc	Thick negative photoresist (thichness: 300 mm)
Triton X-100 (1%)	Thermo Fisher Scientific	HFH10
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056
TWEEN 20	Sigma-Aldrich	P9416