反復可能なパターン形成のためのハイブリッド ゲル キューブ デバイスで初期の 3 D 細胞クラスター制御
Summary
反復可能なパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するための手順を紹介します。組織パターン形成のための多方向の画像を達成するために 2 つの異なるゲルを含む立方デバイスを採用します。
Abstract
3 D 培養の重要性は、細胞培養でかなり強調されます。ただし、実験の再現性の欠如は、その制限の 1 つです。自己組織化メカニズムの解析を低下パターン形成のいくつかの反復可能な結果を生成します。セル密度と細胞外マトリックス (ECM) の分布などの初期培養条件の変化を減らすことは、3次元培養の再現性を強化することが重要です。この記事では、再現性の高いパターン形成を取得する 3 D 細胞外マトリックスの初期細胞クラスター形状を制御するためのシンプルだが強力な手順を示しています。所望の形状とマイクロモールドは、フォトリソグラフィ法や加工法を使用して作製した、ハイブリッド ゲル キューブ (HGC) に含まれる ECM で 3 D ポケットが形成されました。高濃度細胞は、細胞クラスター形状試作金型の形状と一致するよう、ポケットに注入されました。採用の HGC 許可でも、低倍率のレンズを使用した高解像度イメージングと全体の組織構造のキャプチャを有効にその回転走査型多方向。正常ひと気管支上皮細胞は、方法論を示すため使用されました。
Introduction
二次元文化よりもよりよい生物的環境を模倣する 3 D 文化の重要性は、細胞・組織培養1,2,3でかなり強調されます。細胞と細胞外マトリックス (ECM) との間の相互作用は、形態形成4,5について重要な手がかりを提供します。多くの組織の形成は、折りたたみプロセス6、7、陥入8、管状形成9,10などの 3 D 環境の下でだけ現れることができます。ただし、多くの困難は、皿の上実験 2 D から 3 D の実験へと移行研究者を防ぐ。3 D の実験で主な困難の 1 つは、画像の 3 D サンプルの問題です。平面実験と比較して、適切な 3 D 画像の取得はまだ多くの場合困難です。特に、サンプル サイズ低倍率レンズの大きな焦点深度によりミリ波領域に達すると困難な作業は、適切な 3 D 画像を得るします。たとえば、焦点深度は、倍率 × 10 を使用すると、単一のセルのサイズが通常よりも少ない 10 μ m 以上 50 μ m を達する。画像品質を高めるためには、ハイテク顕微鏡システムが開発されている (例えば、2 光子励起顕微鏡11と光シート顕微鏡システム12)、彼らはその高価な価格により限られてが。代わりに、我々 はこれまでハイブリッド ゲル キューブ (HGC) デバイス13をした.デバイスは、ゲルの 2 種類で構成されています: サポート ゲル、コラーゲンなど ECM または文化ゲルとしてマトリゲル agarose。HGC 培養中にサンプルを収集し、アドレスを焦点深度の問題14多方向画像を達成するためにキューブを回転させることができます。
3 D の実験のもう一つの難しさは、3 D 環境の悪い制御により、低再現性です。プラスチックの皿に平面文化とは異なり、初期培養条件の変化は簡単に柔らかい素材で囲まれた 3 D 空間で発生します。実験結果では有意な変化は、次の分析を劣化し、基になるメカニズムをマスクします。空間的バイオプリンティング15,16、17、および足場18、織物繊維などの単一のセルを配置する多くの工学技術が開発されているが、複雑な前処理が必要か具体的には設計された機器。対照的に、HGC19の 3 D セルの配置を達成するための方法論を開発しました。
このプロトコルでは、一般的に使用される装備、HGC の 3 D の初期細胞クラスターの形を制御するための簡単な手順を示します。まず、HGC の作製プロセスを示した。その後、フォトリソグラフィ法や加工法により作製した micromolds は、ECM の任意形状のポケットを生成する HGC に置かれました。その後、遠心分離後の高密度の細胞は、HGC の初期細胞クラスター形状を制御するポケットに注入しました。正確に制御された細胞のクラスターは、HGC のため多くの方向から描出できた。正常ひと気管支上皮 (NHBE) 細胞は、画像品質を高めるための複数方向から初期細胞クラスター形状の制御と枝の画像を示すため使用されました。
Protocol
Representative Results
Discussion
本稿で紹介した方法は簡単、ハイテク機器なく実行できます。同時に、ハイドロゲルの 3 D 空間で正確なセル クラスター形状制御結果が得られます。最初のコントロールの後、皿に培養すると、同じくらい、HGC の細胞が伸長できます。多方向の画像が、顕微鏡を用いた HGC とサンプルを回転させることにより実行され、画像の品質が向上します。彼らは生体適合性がある限り、HGC フレームと…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、日本学術振興会科研費 (18 H 04765) とテニュア ・ トラック制度の普及、文部科学省、日本プログラムによって支えられた財政的に。
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
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