Klusterkontroll har inledande 3D Cell i en Hybrid Gel kub enhet för repeterbara mönster formationer
Summary
Vi presenterar ett förfarande för att styra formen första cellen kluster i en 3D extracellulära matrix att erhålla en repeterbar mönster bildas. En kubikmeter enhet som innehåller två olika hydrogeler är anställd att uppnå mångfasetterat imaging för vävnad mönster bildas.
Abstract
Vikten av in vitro-3D kulturer betonas betydligt i cell-och/eller vävnadskultur. Avsaknaden av experimentella repeterbarhet är dock en av dess begränsningar. Producera några repeterbara resultat av mönster bildas försämras analys av mekanismerna bakom självorganisering. Att minska variationen i inledande odlingsbetingelser, såsom cell densiteten och distribution i extracellulär matrix (ECM), är avgörande att förbättra repeterbarheten hos en 3D kultur. I den här artikeln visar vi en enkel men robust förfarande för kontroll av formen första cellen kluster i en 3D extracellulära matrix att erhålla mycket repeterbara mönster formationer. En micromold med en önskad form var fabricerade med hjälp av photolithographyen eller en bearbetningsprocess, och det bildas en 3D pocket i ECM som ingår i en hybrid gel kub (HGC). Högkoncentrerad celler injicerades då i fickan så att cellen kluster formen matchas med formen fabricerade mögel. De sysselsatta HGC tillåtna mångfasetterat skanning av dess rotation, som aktiverat högupplösta imaging och tillfångatagandet av den hela vävnadsstrukturen även om en låg förstoring lins användes. Normal människa bronkial epitelceller användes för att demonstrera metoden.
Introduction
Vikten av en 3D kultur, som bättre härmar biologiska miljöer än gör en 2D kultur, framhävs avsevärt i cell/vävnad kultur1,2,3. Samspelet mellan celler och extracellulär matrix (ECM) ger viktiga ledtrådar om morfogenes4,5. Många vävnad formationer kan uppstå endast under 3D-miljöer, såsom den fällbara processen6,7, invagination8och tubulär bildande9,10. Men hindra många svårigheter forskare från skifta till 3D experiment från 2D experiment på en maträtt. En av de stora svårigheterna i 3D experiment är frågan om imaging 3D prover. Jämfört med plana experiment, är förvärv av lämpligt 3D-bilder fortfarande utmanande i många fall. I synnerhet är att erhålla en lämplig 3D bild en svår uppgift när stickprovsstorleken når intervallet millimeter på grund av stora fokal djupet i låg förstoring linser. Exempelvis når fokal djupet mer än 50 µm när en 10 x förstoring linsen används medan storleken på den enda cellen är normalt mindre än 10 µm. För att förbättra imaging, högteknologiska mikroskopi system utvecklas (t.ex. två-foton mikroskopi11 och ljus ark mikroskopi system12), men deras tillgänglighet är begränsad på grund av deras dyra pris. Som ett alternativ, har vi tidigare utvecklat en hybrid gel kub (HGC) enhet13. Enheten består av två typer av hydrogeler: agaros som en stöd-gel och en ECM som kollagen eller Matrigel som en kultur-gel. HGC tillåter oss att samla in provet under odling och rotera kuben för att uppnå mångfasetterat imaging, som behandlar de fokala djup problem14.
En annan svårighet i 3D experiment är deras låg repeterbarhet på grund av dålig Verifierbarheten av 3D miljöer. Till skillnad från en planar kultur på en plast maträtt uppstå variationer i de inledande odlingsbetingelserna lätt i en 3D-rymd omgiven av ett mjukt material. En betydande variation i experimentella resultat försämras följande analys och maskerar de bakomliggande mekanismerna. Många engineering tekniker har utvecklats för att rumsligt justera enstaka celler, såsom bioprinting15,16, fiber vävning17och byggnadsställningar18, men de kräver komplexa förbehandling eller specifikt utformad utrustning. Däremot har vi utvecklat en metod för att uppnå 3D celljustering i en HGC19.
I detta protokoll illustrerade vi ett enkelt förfarande med vanliga utrustning för att styra formen 3D första cellen kluster i en HGC. Först, tillverkningsprocessen av HGC visades. Sedan placerades micromolds tillverkade av photolithographyen eller en bearbetningsprocess i HGC att producera en ficka med en godtycklig form i en ECM. Därefter skulle mycket täta celler efter centrifugeringen injiceras i fickan att styra den initiala cell kluster formen i HGC. Exakt kontrollerade cell klustret kunde avbildas från många håll på grund av HGC. Normal människa bronkial (NHBE) epitelceller användes för att Visa kontroll av den initiala cell kluster formen och avbildning av grenarna från flera håll för att förbättra bild kvalitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metoden presenteras i denna uppsats är enkel och kan utföras utan högteknologiska utrustning. Samtidigt, kan ett exakt cell kluster form kontrollresultat i 3D rymden av hydrogel erhållas. Efter den inledande kontrollen, kan cellerna växa i HGC lika mycket som de är odlade på en maträtt. Multi-directional bildtagning utförs av roterande provet med den HGC använder någon mikroskopi system, och det avsevärt förbättrar imaging kvaliteten. Valet av material för HGC ramen och micromold är flexibel så länge de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick ekonomiskt stöd av JSPS KAKENHI (18H 04765) och programmet för att sprida Tenure Track System, MEXT, Japan.
Materials
| 12-well-plate | Corning Inc. | 3513 | |
| 2-Methoxy-1-methylethyl Acetate | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 130-10505 | PGMEA, CAS: 108-65-6 |
| 4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Co. | 161-20141 | CAS: 30525-89-4 |
| Agarose, low gelling temperature BioReagent | Sigma-Aldrich | A9414 | |
| Alexa fluor 488 phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| AZ1512 | Merck | ||
| BEGM bullet kit | Lonza | CC-3170 | Specialized medium for NHBE cells |
| Bovine Serum Albumin solution (10 %) | Sigma-Aldrich | A1595 | |
| EGM-2 bullet kit | Lonza | CC-3162 | Specialized medium for endothelial cells |
| Lipidure | NOF co. | MPC polymer | |
| Matrigel growth factor reduced basement membrane matrix | Corning Inc. | 354230 | |
| Normal Goat Serum (10%) | Thermo Fisher Scientific | 50197Z | |
| Normal human bronchial epithelial cells | Lonza | CC-2541 | |
| SILPOT 184 W/C | Dow Corning Co. | 3255981 | Base resin and catalyst for PDMS |
| SUEX D300 | DJ MicroLaminates, Inc | Thick negative photoresist (thichness: 300 mm) | |
| Triton X-100 (1%) | Thermo Fisher Scientific | HFH10 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P9416 |
References
- Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension – how 3D culture microenvironments alter cellular cues. Journal of Cell Science. 125 (13), 3015-3024 (2012).
- Sasai, Y. Cytosystems dynamics in self-organization of tissue architecture. Nature. 493 (7432), 318-326 (2013).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: Experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Choquet, D., Felsenfeld, D. P., Sheetz, M. P. Extracellular matrix rigidity causes strengthening of integrin- cytoskeleton linkages. Cell. 88 (1), 39-48 (1997).
- Hannezo, E., Prost, J., Joanny, J. -. F. Theory of epithelial sheet morphology in three dimensions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (1), 27-32 (2014).
- Tawk, M., et al. A mirror-symmetric cell division that orchestrates neuroepithelial morphogenesis. Nature. 446 (7137), 797-800 (2007).
- Eiraku, M., et al. Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture. Nature. 472 (7341), 51-58 (2011).
- Zegers, M. M. P., O’Brien, L. E., Yu, W., Datta, A., Mostov, K. E. Epithelial polarity and tubulogenesis in vitro. Trends in Cell Biology. 13 (4), 169-176 (2003).
- Affolter, M., Bellusci, S., Itoh, N., Shilo, B., Thiery, J. P., Werb, Z. Tube or not tube: Remodeling epithelial tissues by branching morphogenesis. Developmental Cell. 4 (1), 11-18 (2003).
- Denk, W., Strickler, J., Webb, W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
- Huisken, J., et al. Optical Sectioning Deep Inside Live Embryos by Selective Plane Illumination Microscopy. Science. , 1007-1009 (2004).
- Hagiwara, M., Kawahara, T., Nobata, R. Tissue in Cube: In Vitro 3D Culturing Platform with Hybrid Gel Cubes for Multidirectional Observations. Advanced Healthcare Materials. 5 (13), 1566-1571 (2016).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. Large Scale Imaging by Fine Spatial Alignment of Multi-Scanning Data with Gel Cube Device. Applied Sciences. 8 (235), (2018).
- Kolesky, D. B., Homan, K. A., Skylar-Scott, M. A., Lewis, J. A. Three-dimensional bioprinting of thick vascularized tissues. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 3179-3184 (2016).
- Mironov, V., Visconti, R. P., Kasyanov, V., Forgacs, G., Drake, C. J., Markwald, R. R. Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials. 30 (12), 2164-2174 (2009).
- Onoe, H., et al. Metre-long cell-laden microfibres exhibit tissue morphologies and functions. Nature Materials. 12 (6), 584-590 (2013).
- Miller, J. S., et al. Rapid casting of patterned vascular networks for perfusable engineered three-dimensional tissues. Nature Materials. 11 (9), 768-774 (2012).
- Hagiwara, M., Nobata, R., Kawahara, T. High repeatability from 3D experimental platform for quantitative analysis of cellular branch pattern formations. Integrative Biology. 10, 306-312 (2018).
- Tainaka, K., et al. Whole-body imaging with single-cell resolution by tissue decolorization. Cell. 159 (4), 911-924 (2014).
- Murray, E., et al. Scalable Proteomic Imaging for High-Dimensional Profiling of Intact Systems. Cell. 163 (6), 1500-1514 (2015).
