Erzeugung, Verstärkung und Titration von rekombinanten Respiratory Syncytial Viren

Summary

Wir beschreiben eine Methode zur Erzeugung und Verstärkung genetisch modifiziert respiratory syncytial Viren (RSV) und eine optimierte Plaque-Assay für RSV. Wir veranschaulichen dieses Protokolls durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren, die Quantifizierung der RSV-Replikation ermöglichen bzw. live-Analyse des RSV Einschlusskörperchen und Einschlusskörperchen-assoziierten Granulat Dynamik.

Abstract

Der Einsatz von rekombinanten Viren ist entscheidend in der Basis- oder angewandte Virologie geworden. Reverse Genetik ist nachgewiesen worden, werden eine extrem leistungsfähige Technologie, sowohl virale Replikationsmechanismen zu entschlüsseln und zu studieren antivirale Medikamente oder Impfstoffe Entwicklungsplattform vorsehen. Den Bau und die Manipulation von einem reverse genetische System für einen negativ-Strang RNA-Virus wie ein respiratory syncytial Virus (RSV), allerdings bleibt zart und erfordert spezielles Know-how. Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, die als Vorlage für die virale RNA-Replikation und Transkription dient. Unser reverse Genetik-System nutzt eine cDNA-Kopie des RSV lange Belastung Humangenoms (HRSV). Diese cDNA sowie cDNAs Codierung virale Proteine der komplexen Polymerase (L, P, N und M2-1) befinden sich in einzelnen Expressionsvektoren unter T7 Polymerase Steuersequenzen. Die Transfektion dieser Elemente in BSR-T7/5 Zellen, die stabil T7 Polymerase ausdrücken, ermöglicht die zytoplasmatischen Replikation und Transkription der rekombinanten RSV zu gentechnisch veränderten Virionen. Eine neue RSV, die an der Zelloberfläche und in der Kultur Überstand des BSRT7/5 vorliegt, ist versammelt, um menschliche HEp-2 Zellen für virale Verstärkung zu infizieren. Zwei oder drei Runden der Verstärkung sind erforderlich, um virale Bestände mit 1 x 10⁶ bis 1 x 10⁷ Plaque-bildenden Einheiten (PFU) / mL. Methoden für die optimale Ernte, Einfrieren und Titration der viralen Bestände sind hier ausführlich beschrieben. Wir illustrieren das Protokoll hier vorgestellten durch die Schaffung von zwei rekombinanter Viren bzw. Ausdruck freies grünes fluoreszierendes Protein (GFP) (RSV-GFP) oder viralen M2-1 mit GFP (RSV-M2-1-GFP) verschmolzen. Wir zeigen, wie mithilfe von RSV-GFP um RSV-Replikation und der RSV-M2-1-GFP viralen Strukturen sowie virale Proteindynamik in lebenden Zellen visualisieren mit Videomikroskopie Techniken zu quantifizieren.

Introduction

Menschlichen RSV ist die führende Ursache der Hospitalisierung für akute Infektion der Atemwege in Säuglinge weltweit¹. RSV ist darüber hinaus mit einer erheblichen Krankheitslast bei Erwachsenen vergleichbar mit Grippe, mit die meisten Krankenhausaufenthalt und Sterblichkeit in der ältere²Belastung verbunden. Gibt es keine Impfstoffe oder spezifische antivirale Medikamente noch gegen RSV, aber vielversprechende neue Medikamente sind in Entwicklung^3,4. Die Komplexität und die Schwere der Techniken der Quantifizierung der RSV Multiplikation erschweren die Suche nach antivirale Medikamente oder Impfstoffe trotz erheblicher Anstrengungen. Die Quantifizierung der RSV Multiplikation in-vitro-basiert im Allgemeinen auf teure, mühsame und zeitraubende Methoden bestehen vor allem in der Analyse des zytopathischen Effekts durch Plaque-Reduzierung, Mikroskopie, Immunostaining Assays, quantitative (qRT) Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) und Enzym-linked Immunosorbentprobe Tests zu bestimmen. Viren mit modifizierten Genomen und mit dem Ausdruck Reporter-Gene, wie die Codierung für die GFP, eignen sich eher für solche Vorführungen. Gekoppelt an die Verwendung von automatisierten Platte Leser, machen Reporter-gen tragenden rekombinante Viren diese Assays für Standardisierung und Hochdurchsatz-Zwecke besser geeignet.

RSV ist eine behüllte, nonsegmented negativen Sinne RNA-Virus, das gehört zur Gattung der Pneumoviridae Familie, Ordnung Mononegavirales⁵ Orthopneumovirus . Der RSV-Genom ist eine Single-Strang, negativen Sinn RNA von ca. 15 kb, enthält eine forensisches Region an den 3′ und 5′ Extremitäten genannt Führer und Anhänger und 10 transkriptionelle Einheiten 11 Proteine codieren. Die Gene sind wie folgt sortiert: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, M2 (M2-1 und M2-2 Proteine kodieren) und L-5 “. Die genomische RNA ist fest Nucleoprotein N. Using Encapsidated genomische RNA als Vorlage verpackt, virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (Trichothecene) Transkription und Replikation der viralen RNA zu gewährleisten. Virale Trichothecene besteht aus der großen Protein L trägt die Nukleotid-Polymeraseaktivität schlechthin, seine obligatorische Cofaktor Phosphoprotein P und das M2-1-Protein, das Funktionen wie eine virale Transkription Faktor⁶. In infizierten Zellen induziert RSV die Bildung von zytoplasmatischen Einschlüssen Einschlusskörperchen (IBs) genannt. Morphologisch ähnliche zytoplasmatischen Einschlüssen sind für mehrere Mononegavirales^7,8,9,10beobachtet worden. Neuere Untersuchungen zu den Tollwut-Virus, vesikuläre Stomatitis-Virus (VSV) und Ebola-Virus RSV hat gezeigt, dass virale RNA-Synthese tritt in IBs, die somit als virale Fabriken^8,9,11, angesehen werden kann ¹². Virus Fabriken konzentrieren die RNA und virale Proteine für virale RNA-Synthese benötigt und enthalten auch zelluläre Proteine^{13,14,15,16, 17}. IBs weisen eine funktionale Subkompartiment genannt IB-assoziierten Granulat (IBAGs), die sich darauf konzentrieren die neu dazu im Entstehen begriffenen viralen mRNA zusammen mit dem M2-1-Protein. Die genomische RNA und die L, P und N werden in IBAGs nicht erkannt. IBAGs sind kleine dynamische kugelförmigen Strukturen im Inneren IBs, die die Eigenschaften des flüssigen Organellen¹²aufweisen. Trotz der zentralen Rolle von IBs in virale Vermehrung ist sehr wenig über Natur, interne Struktur, Entstehung und Betrieb dieser viralen Fabriken bekannt.

Der Ausdruck des Genoms des Poliovirus aus einer cDNA aktiviert die Produktion des ersten ansteckende virale Klons in 1981¹⁸. Für negative einzelsträngigen RNA-Viren fand es nicht bis 1994 die Produktion eines ersten Tollwut-Virus nach Transfektion von Plasmiden in Zellen¹⁹ statt. Das erste Plasmid-basierte reverse genetische System für RSV erschien 1995²⁰. Reverse Genetik führten zu großen Fortschritten auf dem Gebiet der Virologie. Die Möglichkeit der Einführung von spezifischen Änderungen in das virale Genom hat kritische Einblicke in die Replikation und Pathogenese von RNA-Viren zur Verfügung gestellt. Diese Technologie hat die Entwicklung von Impfstoffen auch erheblich erleichtert, indem es spezifische Dämpfung durch gezielte Reihe von Modifikationen erlaubt. Genom Änderungen erlauben eine schnelle Quantifizierung der viralen Vermehrung erheblich verbessert die antivirale Screening und Untersuchung von ihrer Wirkungsweise.

Obwohl zuvor beschrieben, bleibt die Erlangung genetisch veränderten RSV zart. Hier zeigen wir ein Protokoll erstelle ich zwei Arten von rekombinanten HRSV, RSV-GFP oder RSV-M2-1-GFP bzw. zum Ausdruck zu bringen. In diesem Protokoll beschreiben wir die Transfektion Voraussetzungen für die neue rekombinanten Viren, sowie ihre Verstärkung zu viralen Aktien mit hoher Titer, geeignet für reproduzierbare Experimente zu retten. Der Bau der reversen Genetik Vektoren ist per se nicht beschrieben. Wir beschreiben Methoden für die optimale ernten und Einfrieren von viralen Bestände. Die genaueste Methode, infektiöse Viruspartikel zu quantifizieren bleibt Plaque-Assay. Zellen sind infiziert mit seriellen Verdünnungen der analysierten Suspension und inkubiert mit einem Overlay, das verbietet die Verbreitung von freien Viruspartikel im Überstand. Unter solchen Bedingungen wird der Virus nur zusammenhängende Zellen, aus denen eine “Tafel” für jedes erste infektiöse Partikel infizieren. In der konventionellen RSV-Titration-Assay sind Gedenktafeln von Immunostaining aufgedeckt und unter mikroskopischer Beobachtung gezählt. Diese Methode ist teuer und zeitaufwändig. Hier haben wir ein sehr einfaches Protokoll für eine RSV-Plaque-Assay mikrokristalline Cellulose verwenden, die es die Bildung von Plaques, die mit bloßem Auge sichtbar ermöglicht. Wir zeigen, wie RSV-GFP Maßnahme RSV Replikation und damit zum verwendet werden kann die Auswirkungen der antiviralen Medikamenten zu quantifizieren. Kombination von reverse Genetik und live-imaging-Technologie, zeigen wir Ihnen wie RSV-M2-1-GFP ermöglicht es Wissenschaftlern, M2-1 in lebenden Zellen zu visualisieren und die Dynamik der intrazellulären viralen Strukturen wie IBs zu folgen.

Protocol

1. materielle Vorbereitung Zelle Medien zu kaufen (reduzierte Serum Medien, minimale unerlässlich [MEM] 10 x MEM und Dulbecco modifizierten Adlers Medium [DMEM]), Transfection Reagens und mikrokristalline Cellulose (siehe Tabelle der Materialien). Erhalten folgenden Vektoren für reverse Genetik: die genomische Vector(s) und die Codierung des N-Proteins und der Polymerase komplexe Proteine Expressionsvektoren. Die genomischen Vektoren enthalten das volle cDNA Genom der RSV-GLP (p-RSV…

Representative Results

In dieser Arbeit beschrieben, ein detailliertes Protokoll zur Herstellung rekombinanter RSV-Viren mit dem Ausdruck eines fluoreszierenden Proteins (Abbildung 2). Im pRSV-GFP wurde das GFP-gen zwischen dem P und M gen eingeführt, wie für die Kirsche gen zuvor veröffentlichte Arbeit21beschrieben. In pRSV-M2-1-GFP das M2-gen war unangetastet gelassen und ein zusätzliches Gen Kodierung für M2-1-GFP zwischen SH und G Gene<sup class="xr…

Discussion

Hier präsentieren wir eine Methode zur Rettung des rekombinanten RSV aus fünf Plasmide und ihre Verstärkung. Die Fähigkeit zu manipulieren, das Genom der Viren revolutioniert Virologie-Forschung, um Mutationen zu testen und ein zusätzliches Gen oder ein tagged viral Protein ausdrücken. Der RSV haben wir beschrieben und als ein Beispiel in diesem Artikel ist ein Virus mit dem Ausdruck ein Reportergen, RSV-GLP (unveröffentlicht) und drückt eine M2-1-Protein mit einem GLP-Tag¹²verschmolzen. R…

Materials

35mm µ dish for live cell imaging	Ibidi	81156
A549	ATCC	ATCC CCL-185
Avicel RC-591	FMC BioPolymer	Avicel RC-591	Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5		not commercially available	See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution	Sigma	HT90132
Fluorescence microscope for observations	Olympus	IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT	ThermoFisher Scientific	11668019	Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Plasmids		not commercially available	see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker	VWR	444-0341
Si RNA GAPDH	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05	SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005	SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N	Dharmacon	ON-TARGETplus custom siRNA	UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT	Dharmacon	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent	Dharmacon	DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03	Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	ThermoFisher Scientific	25080094
Spectrofluorometer	Tecan	Tecan infinite M200PRO