생성, 증폭 및 재조합 호흡 Syncytial 바이러스의 적정

Summary

우리를 생성 하는 방법을 설명 하 고 RSVs에 대 한 호흡 syncytial 바이러스 (RSVs)와 최적화 된 패 분석 결과 수정 유전자 증폭. 우리는 두 재조합 바이러스는 각각 RSV 복제의 정량화를 허용 하 고 라이브 RSV 포함 몸과 포함 시체 관련 된과 립 역동성의 분석을 생성 하 여이 프로토콜을 설명 합니다.

Abstract

재조합 형 바이러스를 사용 하 여 기본 또는 적용 바이러스학에 중요 한 되고있다. 역 유전학 둘 다 바이러스 성 복제 메커니즘을 해독 하 고 antivirals 연구 개발 플랫폼을 제공 하는 백신에 대 한 매우 강력한 기술 될 입증 되었습니다. 그러나 건설 및 부정적인 물가 RNA 바이러스 호흡 syncytial 바이러스 (RSV)에 대 한 역방향 유전자 시스템의 조작, 섬세 한 남아 있고 특별 한 노하우를 필요로 합니다. RSV 게놈은 약 15 kb는 모두 바이러스 성 RNA 복제 및 전송에 대 한 서식 파일의 단일 스트랜드, 부정 감지 RNA 이다. 우리의 역 유전학 시스템 인간의 RSV 긴 긴장 게놈 (HRSV)의 cDNA 사본을 사용합니다. 이 cDNA, 뿐만 아니라 cDNAs 바이러스 성 단백질의 중 합 효소 복잡 한 인코딩 (L, P, N 및 m 2-1) 개별 식 벡터 T7 중 합 효소 컨트롤 시퀀스 아래에 배치 됩니다. T7 중 합 효소는 안정적으로 표현, BSR-T7/5 셀에 이러한 요소의 transfection 세포질 복제와 재조합 RSV의 전사 유전자 변형된 virions를 야 기한 있습니다. BSRT7/5의 문화 상쾌한와 세포 표면에는, 새로운 RSV 감염 바이러스 성 확대를 위한 인간 형 간염-2 셀에 수집 됩니다. 증폭의 2 개 또는 3 라운드 1 x 10⁶ 1 x 10⁷ 플 라크 형성 단위 (PFU)를 포함 하는 바이러스 성 주식을 얻기 위해 필요 / mL. 최적의 수확, 냉동, 및 바이러스 성 주식의 적정 방법 자세히 여기 설명 합니다. 우리 무료 녹색 형광 단백질 (GFP) (RSV-GFP)를 표현 하는 각각 두 개의 재조합 형 바이러스를 만들어 여기에 제시 된 프로토콜을 설명 하거나 바이러스 M2-1 융합 GFP (RSV-M2-1-GFP). 우리 RSV-GFP를 사용 하 여 계량 RSV 복제와 RSV-M2-1-GFP 비디오 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 살아있는 세포에서 바이러스 성 단백질 역동성 뿐 아니라 바이러스 성 구조를 시각화 하는 방법을 보여 줍니다.

Introduction

인간의 RSV 유아 전세계¹급성 호흡기 감염에 대 한 입원의 주요 원인입니다. 또한, RSV 성인 입원 및 사망 부담 노인²의 대부분과 인플루엔자에 비해 상당한 질병 부담으로 연결 됩니다. 있습니다 없습니다 백신 또는 특정 antivirals RSV에 대 한 약속 하지만 아직 신약 개발^3,4에 있습니다. 복잡성과 RSV 곱셈의 정량화 기법의 무 거 움 antivirals 또는 현재 상당한 노력에도 불구 하 고 백신에 대 한 검색을 방해. 생체 외에서 RSV 곱셈의 정량화 분석 실험, 양적 현미경 검사 법, immunostaining, 플 라크 감소 cytopathic 효과의 분석에서 주로 구성 되어 힘 드는 시간과 비싼 방법에 따라 일반적으로 역전사 (qRT)-연쇄 반응 (PCR), 및 효소 연결 된 immunosorbent 분석 테스트. 수정 된 유전자와 같은 기자 유전자 표현 바이러스는 GFP 코딩, 같은 검 진을 위해 더 적당 한. 자동된 판 독자를 사용 하 여 결합, 기자 재조합 바이러스 유전자를 운반 할 수 있습니다 이러한 분석 표준화 및 높은 처리량을 위해 더 적당 한.

RSV는 엔벌로프된, nonsegmented 부정적인 감 RNA 바이러스 Pneumoviridae 가족, 순서 Mononegavirales⁵ Orthopneumovirus 속에 속하는입니다. RSV 게놈의 약 15, 지도자 및 트레일러와 인코딩 11 단백질의 transcriptional 단위 10 개 3’와 5′ 말단에 noncoding 지역 포함 된 단일 스트랜드, 부정 감지 RNA 이다. 유전자는 다음과 같이 정렬 됩니다: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, m 2 (m 2-1과 m 2-2 단백질에 대 한 인코딩) 및 L-5′. 게놈 RNA는 밀접 하 게 포장 하 여 nucleoprotein 서식 파일로 사용 하는 북 아 일 하 encapsidated 게놈 RNA, 바이러스 성 RNA 의존 RNA 중 합 효소 (RdRp) 전사 및 바이러스 성 RNA의 복제를 보장 합니다. 바이러스 성 RdRp 큰 단백질 L 당 뉴클레오티드 중 합 효소 활동을 운반의 구성, 그것의 필수 공동 인자 phosphoprotein P와 바이러스 성 녹음 방송으로 하는 M2-1 단백질 요소⁶. 감염 된 세포에서 RSV 세포질 포함 이라고 포함 시체 (IBs)의 형성을 유도 합니다. 형태학 상으로 비슷한 세포질 포함 여러 Mononegavirales^7,8,,910관찰 되었습니다. RSV 바이러스 성 RNA 합성 따라서 바이러스 성 공장^8,,911, 로 간주 될 수 있는 IBs에서 발생 하는 것을 보여주었다, 에볼라 바이러스, vesicular 구내 염 바이러스 (VSV), 광견병 바이러스에 대 한 최근 연구 ¹². 바이러스 공장 RNA 그리고 바이러스 성 RNA 합성에 필요한 바이러스 성 단백질을 집중 하 고 또한 포함 하는 세포질 단백질^{13,,1415,16, 17}. IBs 전시 IB 관련 된과 립 (IBAGs), 집중 하 라는 기능 subcompartment는 새로 synthetized M2-1 단백질 함께 초기 바이러스 성 mRNA. 게놈 RNA와 L, P, 그리고 N IBAGs에서 검색 되지 않습니다. IBAGs는 액체 세포¹²의 속성을 전시 하는 IBs 안에 작은 동적 구형 구조. IBs 중앙 역할 바이러스 곱셈에 불구 하 고 아주 작은 자연, 내부 구조, 형성, 및이 바이러스 성 공장 운영에 대 한 알려져 있다.

한 cDNA에서 소아마비의 게놈의 식 1981¹⁸첫 번째 전염 성 바이러스 성 복제의 생산을 사용할 수 있습니다. 단일 가닥 부정적인 RNA 바이러스, 그것 아니었다 1994 년까지 셀¹⁹ 에 플라스 미드의 transfection를 다음 첫 번째 광견병 바이러스의 생산 장소를 했다. 첫 번째 플라스 미드 역 유전 위한 기반 시스템 RSV 1995²⁰에 출판 되었음. 역 유전학 바이러스학의 분야에서 큰 발전을이 끌고있다. 바이러스 성 게놈에 특정 수정 소개의 가능성 복제 및 RNA 바이러스의 병 인에 중요 한 통찰력을 제공 하고있다. 이 기술은 수정 대상된 시리즈를 통해 특정 감쇄 함으로써 백신의 개발을 촉진 또한 크게 있다. 크게 바이러스 곱셈의 급속 한 정량화를 허용 하는 게놈 수정 개선 항 바이러스 검사 및 행동의 그들의 모드의 연구.

앞서 설명한 유전자 변형된 RSVs 취득 남아 있다 섬세 한. 여기, 우리는 프로토콜 각각 RSV GFP 또는 RSV-M2-1-GFP를 표현 하는 재조합 HRSV 두 가지 유형의 만들을 선발. 이 프로토콜에서 우리는 새로운 재조합 형 바이러스로 바이러스 주식 높은 titer, 재현성 실험에 적합을 얻기 위해 그들의 증폭을 구출 하는 데 필요한 transfection 조건 설명 합니다. 반전 유전학 벡터의 건설 라기보다 여기 설명 되지 않은입니다. 우리 할 최적의 수확 및 바이러스 성 주식의 동결에 대 한 방법을 설명 합니다. 바이러스 성 전염 성 입자를 계량 하는 가장 정확한 방법은 패 분석 실험에 남아 있다. 셀 직렬 희석 분석 된 서 스 펜 션의 감염 되며는 상쾌한에 무료 바이러스 성 입자의 유포를 금지 하는 오버레이 함께 알을 품을. 이러한 조건에서 바이러스는 각 초기 전염 성 입자에 대 한 “패”를 형성 하는 인접 셀만 감염 됩니다. 기존 RSV 적정 분석 결과, 플 라크는 immunostaining에 의해 공개 하 고 현미경 관찰에서 계산. 이 메서드는 비싸고 시간이 많이 소요. 여기 우리는 육안으로 보이는 플 라크의 형성을 가능 하 게 미정 질 셀 루 로스 오버레이 사용 하 여 RSV 패 분석 결과 대 한 매우 간단한 프로토콜을 설명 합니다. 우리가 측정 RSV 복제 하 고, 따라서, RSV GFP를 사용할 수 있습니다 어떻게 보여 antivirals의 영향을 계량화. 역 유전학 및 라이브 이미징 기술을 결합, RSV-M2-1-GFP 과학자 M2-라이브 셀에 1을 시각화 하 고 세포내 바이러스 구조, IBs 등의 역학 관계에 따라 있도록 하는 방법을 설명 합니다.

Protocol

1. 재료 준비 세포 미디어 구매 (감소 된 혈 청 미디어, 최소 필수 미디어 [메모리] 메모리, 그리고 Dulbecco x 10의 수정이 글의 중간 [DMEM]) transfection 시 약 및 미정 질 셀 루 로스 ( 재료의 표참조). 반전 유전학에 대 한 다음 벡터를 얻기: 게놈 vector(s) 및 인코딩 N 단백질 및 중 합 효소 복잡 한 단백질 식 벡터. 게놈 벡터 포함 살 균 소 T7 RNA 중 합 효소 (pol T7) 발기인에서 전체 c…

Representative Results

이 작품에서 우리는 (그림 2) 형광 단백질을 표현 하는 재조합 RSV 바이러스를 생산 하는 상세한 프로토콜을 설명. PRSV-GFP, GFP 유전자가 이전에 게시 작업21벚꽃 유전자에 대 한 설명 된 대로 P와 M 유전자 사이 도입 되었다. pRSV-M2-1-GFP, M2 유전자가 온전히 남아 그리고 SH와 G 유전자12사이 삽입 했다 M2-1-GFP에 대 한 추가 …

Discussion

여기 선물이 5 플라스 미드에서 재조합 RSVs의 구조 하는 방법 및 그들의 증폭. 바이러스의 게놈을 조작 하는 기능 돌연변이 테스트 하 고 추가 유전자 또는 태그 바이러스 성 단백질을 표현 하는 바이러스학 연구를 혁명을 했다. RSV 우리 설명 하 고이 문서에서는 예를 들어 바이러스 취재 원 유전자, RSV-GFP (미 발표)와 M2-1 단백질 GFP 태그¹²에 융합 하는 표현으로 사용. RSV 구조 도전 …

Materials

35mm µ dish for live cell imaging	Ibidi	81156
A549	ATCC	ATCC CCL-185
Avicel RC-591	FMC BioPolymer	Avicel RC-591	Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5		not commercially available	See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution	Sigma	HT90132
Fluorescence microscope for observations	Olympus	IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy	Olympus	ScanR Olympus microscope
HEp-2	ATCC	ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5%	Sigma	H3375
L-Glutamine (200 mM)	ThermoFisher Scientific	25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT	ThermoFisher Scientific	11668019	Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine	ThermoFisher Scientific	11430030
MEM, GlutaMAX Supplement	ThermoFisher Scientific	41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5%	Sigma	M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium	ThermoFisher Scientific	51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade	Electron Microscopy Sciences	15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher Scientific	15140122
Plasmids		not commercially available	see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker	VWR	444-0341
Si RNA GAPDH	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA D-001810-10-05	SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2	Dharmacon	ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human L-004330-00-0005	SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon. Individual references and sequences J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA; J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC; J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU; J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N	Dharmacon	ON-TARGETplus custom siRNA	UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT	Dharmacon	ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent	Dharmacon	DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03	Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution	ThermoFisher Scientific	25080094
Spectrofluorometer	Tecan	Tecan infinite M200PRO