JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Immunology and Infection

Поколение, усилители и титрование рекомбинантных респираторных вирусов-синцитиальный

Published: April 04, 2019
doi:
10.3791/59218
, , , , , , ,
1UMR 1173 Institut national de la santé et de la recherche médicale (INSERM),Université de Versailles St. Quentin, 2UR892 Institut national de la recherche agronomique (INRA), Unité de virologie et immunologie moléculaires, 3Assistance Publique–Hôpitaux de Paris (AP-HP), Hôpital Ambroise Paré, Laboratoire de Microbiologie

Summary

Мы описываем метод для генерации и усиления генетически модифицированные синцитиальный респираторных вирусов (RSVs) и оптимизированной налета assay RSVs. Проиллюстрируем этот Протокол путем создания двух рекомбинантных вирусов, которые соответственно дать количественную оценку данной RSV репликации и жить анализ RSV включения органов и органов включение связанных гранулы динамики.

Abstract

Применение рекомбинантного вирусов приобрел решающее значение в основных или прикладной вирусологии. Было доказано обратного генетика быть чрезвычайно мощная технология, как расшифровать механизмы вирусной репликации и для изучения противовирусные препараты или предоставить платформу для разработки вакцин для. Строительство и манипуляции обратный генетической системы для отрицательные strand РНК вируса таких респираторно-синцитиальный вирус (RSV), однако, остается нестабильным и требует специального ноу-хау. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который служит в качестве шаблона для вирусной РНК репликации и транскрипции. Наша система обратной генетики использует cDNA копию генома человека RSV длинные штамм (HRSV). Этот cDNA, а также cDNAs кодирования вирусные белки комплекс полимеразы (L, P, N и м2-1), помещаются в отдельные выражения векторов под T7 полимеразы управляющие последовательности. Трансфекция этих элементов в ЧКР-T7/5 клеток, которые стабильно Экспресс T7 полимеразы, позволяет цитоплазматических репликации и транскрипции рекомбинантных RSV, рождая генетически модифицированных вирионов. Новый RSV, которая присутствует на поверхности клеток и в надосадке культуры BSRT7/5, собирается для того, чтобы заразить клетки человека HEp-2 для амплификации вирусной. Два или три круга усиления необходимы для получения вирусных запасов, содержащих 1 x 10-6 до 1 x 107 металлическ формируя единиц (ОРП) / мл. Здесь подробно описаны методы для оптимального сбора урожая, замораживания и титрование вирусных запасов. Мы иллюстрируем протокола, представленные здесь, создав две рекомбинантных вирусов, соответственно выражая бесплатно Зеленый флуоресцентный белок (ГПУП) (RSV-GFP) или вирусный м2-1 сливается с GFP (RSV-м2-1-ГФП). Мы покажем, как использовать RSV-GFP квантифицировать RSV репликации и RSV-м2-1-GFP визуализировать вирусный структур, а также динамика вирусных белков в живой клетке, с использованием методов видео микроскопии.

Introduction

RSV человека является основной причиной госпитализации для острой инфекции дыхательных путей в младенцев во всем мире1. Кроме того RSV ассоциируется с существенной заболеваемости в сопоставимых с гриппом, с большинством госпитализации и бременем смертности в пожилых2взрослых. Не существует вакцины или конкретных противовирусные препараты доступны еще против RSV, но перспективных новых препаратов находятся в развития3,4. Сложности и тяжести методы количественной оценки RSV умножения затрудняют поиск противовирусные препараты и вакцины, несмотря на значительные усилия, прилагаемые. Количественная оценка RSV умножения в пробирке обычно основана на трудоемкий, длительным и дорогостоящим методы, которые состоят главным образом в анализе цитопатического эффекта микроскопии, иммуноокрашивания, сокращение зубного налета анализов, количественные обратной транскриптазы (qRT)-полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа тестов. Вирусы с модифицированных геномов и выражая репортер генов, например кодирования для GFP, являются более подходящими для таких фильмов. В сочетании с использованием автоматизированных пластины читателей, Репортер ген нося рекомбинантных вирусы могут сделать эти анализы больше подходит для целей стандартизации и высок объём.

RSV является запечатанным, палочкоядерных отрицательный смысл РНК вирус, который принадлежит к роду Orthopneumovirus из Mononegaviralesсемьи, порядок Pneumoviridae ,5. Геном RSV является одной strand, отрицательные чувство РНК около 15 КБ, который содержит некодирующей региона на 3 и 5′ конечностей, назвал лидера и трейлер и 10 transcriptional единиц кодирования 11 белков. Гены упорядочиваются следующим: 3′-NS1, NS2, N, P, M, SH, G, F, м2 (кодировка для белков м2-1 и м2-2) и L-5′. Геномной РНК плотно упакованы, Нуклеопротеиды N. Using encapsidated геномной РНК как шаблон, вирусной РНК зависимой РНК-полимеразы (RdRp) обеспечит транскрипцию и репликацию вирусной РНК. Вирусных RdRp состоит из большой белка L, который осуществляет действие полимеразы нуклеотида таковой, ее обязательной кофактор фосфоропротеид P и м2-1 белок, который функционирует как вирусный транскрипции фактор6. В инфицированных клетках RSV индуцирует образование цитоплазматических включений, называется включением органов (IBs). Морфологически похожие цитоплазматических включений было отмечено несколько Mononegavirales7,8,9,10. Недавние исследования на вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита (ВСВ), вирус Эбола и RSV, показал, что синтез вирусной РНК происходит в IBs, которые таким образом могут рассматриваться как вирусные фабрики8,9,11, 12. вирус фабрики сконцентрировать РНК и вирусные белки, необходимые для синтеза вирусной РНК и также содержат клеточных белков13,14,,1516, 17. IBs выставлять функциональный subcompartment, называется IB-связанные гранулы (IBAGs), которые концентрируют вновь синтезированный зарождающейся вирусный мРНК вместе с белком м2-1. Геномной РНК и L, P и N не обнаруживаются в IBAGs. IBAGs являются небольшие динамические сферических структуры внутри IBs, которые демонстрируют свойства жидкого органеллы12. Несмотря на центральную роль IBs в Вирусный умножения очень мало известно о природе, внутренняя структура, формирования и функционирования этих вирусные фабрики.

Выражение геном полиовируса из cDNA включено производство первых инфекционные вирусные клон в 1981 году18. Для отрицательных в одноцепочечной РНК-вирусов было не до 1994 года производство первого вируса бешенства, после трансфекции плазмид в клетки19 имели место. Первый на основе плазмида обратный генетической системы для RSV был опубликован в 1995 году20. Обратный генетики привели к крупным достижениям в области вирусологии. Возможность внесения конкретных изменений в вирусного генома предоставил критических идеи на репликации и патогенеза РНК-вирусов. Эта технология также значительно облегчило разработку вакцин, позволяя конкретных затухания через целевые серии модификаций. Изменения генома, позволяя быстрое количественного определения вирусных умножения значительно улучшена антивирусной проверки и изучения режима их действий.

Хотя ранее описанных, получение генетически модифицированных RSVs остается нестабильным. Здесь мы подробно протокол для создания двух типов рекомбинантных HRSV, соответственно, выражая RSV-GFP или RSV-м2-1-GFP. В этом протоколе мы описываем трансфекции условия, необходимые для спасения рекомбинантных новых вирусов, а также их усиления для получения вирусных запасов с высокий титр, подходит для воспроизводимых экспериментах. Строительство векторов обратной генетики per se не описано здесь. Мы описывают методы для оптимального сбора урожая и замораживание вирусных запасов. Наиболее точным методом для количественного определения вирусных инфекционных частиц остается assay металлической пластинкы. Клетки инфицированные серийных разведений анализируемого подвески и инкубировали с накладкой, который запрещает распространение свободных вирусных частиц в надосадке. В таких условиях вирус будет только заразить смежных ячеек, образуя «налет» для каждой первоначальной инфекционные частицы. В обычных assay титрования RSV бляшками выявлены, иммуноокрашивания и учитываются в микроскопические наблюдения. Этот метод является дорогостоящим и трудоемким. Здесь мы описали очень простой протокол для assay металлической пластинкы RSV, используя микрокристаллическая оверлея, который позволяет образованию бляшек, видимых невооруженным глазом. Мы покажем, как RSV-GFP может использоваться мера RSV репликации и, таким образом, для количественной оценки воздействия противовирусных препаратов. Сочетание обратной генетики и живой технологии визуализации, мы демонстрируем, как RSV-м2-1-GFP позволяет ученым визуализировать м2-1 в живых клеток и следовать за динамику внутриклеточная вирусная структур, таких как IBs.

Protocol

1. Подготовка Приобрести мобильные средства массовой информации (сокращение сыворотке СМИ, минимум основных СМИ [мкм], 10 x MEM и Дульбекко модифицированная орла средних [DMEM]), transfection реагента и микрокристаллическая целлюлоза (см. Таблицу материалы). Получить следующую в?…

Representative Results

В этой работе мы описали подробный протокол производить рекомбинантные RSV вирусов, выражая флуоресцентный белок (рис. 2). В pRSV-GFP гена GFP была введена между P и M генов, как описано для вишни гена в ранее опубликованной работе21. В pRSV м2-1-GFP м2 ген б…

Discussion

Здесь мы представляем метод спасения рекомбинантного RSVs из пяти плазмид и их усиление. Возможность манипулировать геном вируса революционизировало вирусологии исследования для тестирования мутации и выразить дополнительных гена или тегами вирусного белка. RSV мы описал и используетс…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят д-р Юй Цинь от компании АстраЗенека R & D Бостон, MA, США, за предоставление AZD4316 наркотиков. Авторы благодарны Cymages платформу для доступа к Микроскоп ScanR Olympus, которое было поддержано гранты от региона Иль (DIM один здоровья). Авторы признают поддержки от INSERM и Университет Версаль Сен-Кантен.

Materials

35mm µ dish for live cell imaging Ibidi 81156
A549 ATCC ATCC CCL-185
Avicel RC-591 FMC BioPolymer Avicel RC-591 Technical and other information on Avicels is available at http://www.fmcbiopolymer.com. Store at room temperature. Protocol in step 4 is optimized for this reagent.
BSRT7/5 not commercially available See ref 22. Buchholz et al, 1999
Crystal violet solution Sigma HT90132
Fluorescence microscope for observations Olympus IX73 Olympus microscope
Fluorescence microscope for videomicroscopy Olympus ScanR Olympus microscope
HEp-2 ATCC ATCC CCL-23
HEPES ≥99.5% Sigma H3375
L-Glutamine (200 mM) ThermoFisher Scientific 25030024
LIPOFECTAMINE 2000 REAGENT ThermoFisher Scientific 11668019 Protocol in step 2.3. is optimized for this reagent.
MEM (10X), no glutamine ThermoFisher Scientific 11430030
MEM, GlutaMAX Supplement ThermoFisher Scientific 41090-028
MgSO4 ReagentPlus, ≥99.5% Sigma M7506
Opti-MEM I Reduced Serum Medium ThermoFisher Scientific 51985-026
Paraformaldehyde Aqueous Solution, 32%, EM Grade Electron Microscopy Sciences 15714
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) ThermoFisher Scientific 15140122
Plasmids not commercially available see ref 21. Rameix-Welti et al, 2014
See Saw Rocker VWR 444-0341
Si RNA GAPDH Dharmacon ON-TARGETplus siRNA
D-001810-10-05		 SMARTpool and 3 of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Si RNA IMPDH2 Dharmacon ON-TARGETplus siRNA IMPDH2 Pool- Human
L-004330-00-0005		 SMARTpool of 4 individual siRNAs designed by Dharmacon.
Individual references and sequences
J-004330-06: GGAAAGUUGCCCAUUGUAA;
J-004330-07: GCACGGCGCUUUGGUGUUC;
J-004330-08: AAGGGUCAAUCCACAAAUU;
J-004330-09: GGUAUGGGUUCUCUCGAUG;
Si RNA RSV N Dharmacon ON-TARGETplus custom siRNA UUCAGAAGAACUAGAGGCUAU and UUUCAUAAAUUCACUGGGUUA
SiRNA NT Dharmacon ON-TARGETplus Non-targeting Pool
SiRNA transfection reagent Dharmacon DharmaFECT 1 Ref: T-2001-03 Protocol in steps 5.1.and 5.1.2 are optimized for this reagent.
Sodium Bicarbonate 7.5% solution ThermoFisher Scientific 25080094
Spectrofluorometer Tecan Tecan infinite M200PRO
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shi, T., et al. Global, regional, and national disease burden estimates of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children in 2015: a systematic review and modelling study. The Lancet. 390 (10098), 946-958 (2017).
  2. Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. Respiratory Syncytial Virus Infection in Elderly and High-Risk Adults. The New England Journal of Medicine. 352 (17), 1749-1759 (2005).
  3. DeVincenzo, J. P., et al. Activity of Oral ALS-008176 in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 373 (21), 2048-2058 (2015).
  4. DeVincenzo, J. P., et al. Oral GS-5806 Activity in a Respiratory Syncytial Virus Challenge Study. The New England Journal of Medicine. 371 (8), 711-722 (2014).
  5. Afonso, C. L., et al. Taxonomy of the order Mononegavirales: update 2016. Archives of Virology. 161 (8), 2351-2360 (2016).
  6. Collins, P. L., Hill, M. G., Cristina, J., Grosfeld, H. Transcription elongation factor of respiratory syncytial virus, a nonsegmented negative-strand RNA virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (1), 81-85 (1996).
  7. Hoenen, T., et al. Inclusion bodies are a site of ebolavirus replication. Journal of Virology. 86 (21), 11779-11788 (2012).
  8. Heinrich, B. S., Cureton, D. K., Rahmeh, A. A., Whelan, S. P. Protein expression redirects vesicular stomatitis virus RNA synthesis to cytoplasmic inclusions. PLoS Pathogens. 6 (6), e1000958 (2010).
  9. Lahaye, X., et al. Functional Characterization of Negri Bodies (NBs) in Rabies Virus-Infected Cells: Evidence that NBs Are Sites of Viral Transcription and Replication. Journal of Virology. 83 (16), 7948-7958 (2009).
  10. Kolesnikova, L., Mühlberger, E., Ryabchikova, E., Becker, S. Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology. 74 (8), 3899-3904 (2000).
  11. Dolnik, O., Stevermann, L., Kolesnikova, L., Becker, S. Marburg virus inclusions: A virus-induced microcompartment and interface to multivesicular bodies and the late endosomal compartment. European Journal of Cell Biology. 94 (7-9), 323-331 (2015).
  12. Rincheval, V., et al. Functional organization of cytoplasmic inclusion bodies in cells infected by respiratory syncytial virus. Nature Communications. 8 (1), 563 (2017).
  13. Santangelo, P. J., Bao, G. Dynamics of filamentous viral RNPs prior to egress. Nucleic Acids Research. 35 (11), 3602-3611 (2007).
  14. Lifland, A. W., et al. Human Respiratory Syncytial Virus Nucleoprotein and Inclusion Bodies Antagonize the Innate Immune Response Mediated by MDA5 and MAVS. Journal of Virology. 86 (15), 8245-8258 (2012).
  15. Garcia, J., Garcia-Barreno, B., Vivo, A., Melero, J. A. Cytoplasmic inclusions of respiratory syncytial virus-infected cells: formation of inclusion bodies in transfected cells that coexpress the nucleoprotein, the phosphoprotein, and the 22K protein. Virology. 195 (1), 243-247 (1993).
  16. Brown, G., et al. Evidence for an association between heat shock protein 70 and the respiratory syncytial virus polymerase complex within lipid-raft membranes during virus infection. Virology. 338 (1), 69-80 (2005).
  17. Radhakrishnan, A., et al. Protein analysis of purified respiratory syncytial virus particles reveals an important role for heat shock protein 90 in virus particle assembly. Molecular & Cellular Proteomics. 9 (9), 1829-1848 (2010).
  18. Racaniello, V. R., Baltimore, D. Cloned poliovirus complementary DNA is infectious in mammalian cells. Science. 214 (4523), 916-919 (1981).
  19. Schnell, M. J., Mebatsion, T., Conzelmann, K. K. Infectious rabies viruses from cloned cDNA. The EMBO Journal. 13 (18), 4195-4203 (1994).
  20. Collins, P. L., et al. Production of infectious human respiratory syncytial virus from cloned cDNA confirms an essential role for the transcription elongation factor from the 5′ proximal open reading frame of the M2 mRNA in gene expression and provides a capability for vaccine. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 92 (25), 11563-11567 (1995).
  21. Rameix-Welti, M. -. A., et al. Visualizing the replication of respiratory syncytial virus in cells and in living mice. Nature Communications. 5, 5104 (2014).
  22. Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. Journal of Virology. 73 (1), 251-259 (1999).
  23. Cianci, C., Meanwell, N., Krystal, M. Antiviral activity and molecular mechanism of an orally active respiratory syncytial virus fusion inhibitor. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 55 (3), 289-292 (2005).
  24. Derscheid, R. J., et al. Human respiratory syncytial virus memphis 37 grown in HEp-2 cells causes more severe disease in lambs than virus grown in vero cells. Viruses. 5 (11), 2881-2897 (2013).
  25. McKimm-Breschkin, J. L. A simplified plaque assay for respiratory syncytial virus – direct visualization of plaques without immunostaining. Journal of Virological Methods. 120, 113-117 (2004).
  26. Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 7, 1-7 (2006).
  27. Novina, C. D., Sharp, P. A. The RNAi revolution. Nature. 430 (6996), 161-164 (2004).
  28. Sintchak, M. D., Nimmesgern, E. The structure of inosine 5′-monophosphate dehydrogenase and the design of novel inhibitors. Immunopharmacology. 47 (2-3), 163-184 (2000).
  29. Beaucourt, S., Vignuzzi, M. Ribavirin: A drug active against many viruses with multiple effects on virus replication and propagation. Molecular basis of ribavirin resistance. Current Opinion in Virology. 8, 10-15 (2014).
  30. Hruska, J. F., Bernstein, J. M., Douglas, R. G., Hall, C. B. Effects of Ribavirin on Respiratory Syncytial Virus in vitro. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 17 (5), 770-775 (1980).
  31. Simões, E. A. F., et al. Past, Present and Future Approaches to the Prevention and Treatment of Respiratory Syncytial Virus Infection in Children. Infectious Diseases and Therapy. 7 (1), 87-120 (2018).
  32. Alvarez, R., et al. RNA interference-mediated silencing of the respiratory syncytial virus nucleocapsid defines a potent antiviral strategy. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (9), 3952-3962 (2009).
  33. DeVincenzo, J., et al. A randomized, double-blind, placebo-comtrolled study of an RNAi-based therapy directed against respiratory syncytial virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (19), 8800-8805 (2010).
  34. Zhou, Y., et al. High-throughput screening of a CRISPR/Cas9 library for functional genomics in human cells. Nature. 509 (7501), 487-491 (2014).
  35. Nikolic, J., et al. Negri bodies are viral factories with properties of liquid organelles. Nature Communications. 8 (1), 58 (2017).

Tags

Recombinant Respiratory Syncytial VirusVirus RescueVirus AmplificationVirus TitrationBSR-T7/5 CellsTransfectionHEp-2 CellsVirus Stock GenerationVirological Studies
check_url/59218?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Bouillier, C., Rincheval, V., Sitterlin, D., Blouquit-Laye, S., Desquesnes, A., Eléouët, J., Gault, E., Rameix-Welti, M. Generation, Amplification, and Titration of Recombinant Respiratory Syncytial Viruses. J. Vis. Exp. (146), e59218, doi:10.3791/59218 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image