نقدم هنا بروتوكول وصف الإعداد سيلولو في بي بي بي (حاجز الدم في الدماغ)-إدراج الثقافة البوليستر مسامية الغشاء مينيبرين النظام بغية تقييم نقل الجزيئات الحيوية أو العوامل المعدية عبر BBB بشرية وعلى فسيولوجية تؤثر على خلايا المخ المجاورة.
وقت مبكر فحص الأدوية العصبي على صلة وموثوق بها في طراز بي بي بي سيلولو على الاختراق وتفاعلها مع الحاجز ولحمة الدماغ ما زالت حاجة غير ملباة. ولسد هذه الفجوة، قمنا بتصميم 2D في نموذج سيلولو، بي بي بي-مينيبرين، من خلال الجمع بين من بوليستر في الأغشية المسامية الثقافة إدراج البشرية BBB النموذجي مع مينيبرين التي شكلتها ثقافة ثلاثي لخلايا الدماغ البشري (الخلايا العصبية وخلايا microglial astrocytes). BBB-مينيبرين سمح لنا باختبار نقل مرشح المخدرات محصن (على سبيل المثال، نيوروفيتا)، عن طريق بي بي بي، لتحديد استهداف محددة لهذا الجزيء على الخلايا العصبية، وإظهار أنه كان الحفاظ على الممتلكات محصن من المخدرات بعد المخدرات قد عبرت بي بي بي. كما أثبتنا أن BBB-مينيبراين يشكل نموذجا جديرا باهتمام للكشف عن مرور جزيئات الفيروس عبر حاجز غشائي الخلايا ومراقبة العدوى من مينيبراين بجسيمات الفيروس نيوروينفاسيفي. BBB-مينيبرين نظام موثوق به، سهلة للتعامل مع الباحثين المدربين في خلية ثقافة التكنولوجيا والتنبؤيه لتعمل خلايا الدماغ بعد العلاج أو الإهانة. الفائدة من هذا القبيل في اختبار سيلولو ستكون ذات شقين: إدخال ديريسكينج خطوات مبكرة في وضع المخدرات من جهة، والحد من استخدام الحيوانات في التجارب من ناحية أخرى.
الدماغ يفصلها عن الدوران الجهازي بنية غير المسامية التي تحد من التبادل بين حمة المخ، والدم، ويسمى حاجز الدم في الدماغ (BBB). معظمها تتألف من خلايا بطانة الأوعية الدموية الدماغية، بي بي بي بشكل حيوي تتفاعل مع astrocytes وارتشاح microglia والخلايا العصبية من حمة المخ المجاورة. أن المهام الرئيسية الثلاث ل BBB هي إنشاء وصيانة التوازن الأيوني للوظائف العصبية، إمداد الدماغ بالمواد المغذية، والحماية من الإصابات السمية أو دخول مسببات الأمراض1،2، التي تسهم في الحفاظ على التوازن في الدماغ ولها وظائف3. هذا الحاجز كفاءة حتى أن المخدرات قليلة فقط يمكن عبر4،بي بي بي5. وفي الوقت الحاضر، الأساليب المتاحة للتنبؤ بما إذا كان جزيء سيتم تمرير BBB ومنتشر في المخ تتكون من السابقين فيفو الدراسات المتعلقة بتتبع الصورة المادية، تشريح الجثة في دماغ متطوعين من البشر بالتصوير بالرنين المغناطيسي (التصوير بالرنين المغناطيسي) أو الحيوانات الأليفة (الانبعاث المركز التصوير المقطعي) أو الدوائية والدراسات السريرية الحرائك الدوائية في الحيوانات6،،من78. هذه التقنيات ونماذج لها بعض القيود، مثل القرار محدودة من الحيوانات الأليفة وانخفاض حساسية التصوير بالرنين المغناطيسي6،8، صعوبة تحديد حجم الجزيئات (أي جزيئات الأجسام المضادة التي تعتمد على سبيل المثال) أن سوء اختراق الدماغ7، الإكلينيكية دراسات تكلفة مرتفعة، ومنتجع للتجارب الحيوانية.
والنقطة الأخيرة مهم لأنه، حسب 3R القواعد (الاستبدال والحد وصقل التجارب الحيوانية) طلبت الإدارات التنظيمية أن الباحثين على وجه السرعة إيجاد بديل علمياً دقيقا للحيوان التجريب9،10،11،،من1213،،من1415.
على مدى العقود الماضية، واقترحت عدة نماذج في المختبر من بي بي بي16،،من1718 بزراعة على تصفية غشاء إدراج خلايا بطانية من مختلف الأنواع مثل الماوس والفئران والأبقار والخنازير. وبقدر ما يتعلق بالجنس البشري، توافر الخلايا الأولية النادرة والصعبة دفعت الباحثين تطوير نماذج البشرية تستند إلى خلايا الدماغ مخلدة بطانية أو الخلايا الجذعية المشتقة من الإنسان19،20، 21. هذه الحواجز هي البدائل المناسبة في المختبر من BBB شريطة أن يعربون عن علامات خلية بطانية، علامات تقاطع ضيق، والناقلين افلوكس، ذائبة الناقلين، المستقبلات، والاستجابة ل المحفزات غشائي 20. كانت جزيئي عدد قليل من النماذج بي بي بي باستخدام تصفية غشاء إدراجات المغلفة مع خلايا بطانية وأنواع الخلايا الأخرى (أي، أستروسيتيس، والخلايا العصبية أو بيريسيتيس22،23،24). والهدف من هذه الثقافات المشتركة زيادة الخصائص الفيزيائية BBB بالاستفادة من إفراز العوامل القابلة للذوبان astrocytes/الخلايا العصبية أو بيريسيتيس.
ومع ذلك، يتضمن أيا من هذه النماذج حمة الدماغ الدراسة والتنبؤ بمصير مرشح المخدرات بعد أن اجتاز الحاجز. ولذلك، كان هدفنا بناء سيلولو في الدم/الدماغ واجهة, BBB-مينيبرين، بالجمع بين نموذج BBB وثقافة من خلايا المخ المختلطة في مجموعة واحدة. BBB-مينيبرين يستخدم نظام ثقافة يتكون من عامل تصفية مسامية إدراجها في بئر لوحة الثقافة خلية مولتيويل. عامل التصفية فهي مغلفة بالخلايا هكميك/D3، خط خلية غشائي دماغ البشري قد ثبت موثوق بها للغاية لاختبار25،،من2627، لتشكيل BBB المخدرات بي بي بي. مينيبرين، التي هي ثقافة المشاركة متباينة من الخلايا العصبية البشرية و astrocytes المستمدة من28،خط الخلية NTera/Cl2.D129 مختلطة جنبا إلى جنب مع خط الخلية البشرية microglial Cl5 كم/30 بالنسبة المقابلة microglia مقابل نسب astrocytes العصبية ل الدماغ31، يزرع في الجزء السفلي من اللوحة جيدا.
إلى جانب دراسة مرور المخدرات عبر BBB ومصيرهم في حمة، واجهة الدم في الدماغ في طراز سيلولو يمكن أن تكون أداة قوية لمعالجة دخول مسببات الأمراض في الدماغ (نيوروينفاسيفينيس)، التشتت في الدماغ (نيوروتروبيسم) والسمية (الفوعة العصبية) أنها يمكن أن تمارس على خلايا المخ الحشوي. ستستفيد من تطوير الكفاءة في نموذج سيلولو الدراسات الفوعة العصبية ونيوروينفاسيفينيس ويكون مفيداً لتحل محل النماذج الحيوانية. استخدام طقم BBB-مينيبرين32، أثبتنا النمط الظاهري نيوروينفاسيفي من طفرات الفيروسية النادرة التي تراكمت في سلالة الفيروس “تم الفرنسية” من “فيروس الحمى الصفراء” (أي، الهولندي-يفف،من3334) المستخدمة لإعداد وقف لقاح يفف الحي ومرور بيوموليكولي نيوروريجينيراتيفي ومحصن تسمى نيوروفيتا (يشار بولاية نيفادا من الآن فصاعدا في المخطوطة)35. لأن NV بطبيعة الحال لا يعبر غشاء الخلية ولا بي بي بي، نيفادا تنصهر مع الجزء المتغير (فة) من جسم واحد في سلسلة من اللاما تعبر الأغشية البيولوجية بما في ذلك بي بي بي ويعمل كخلية اختراق جزيء (CPM)36. ويبدو ممتلكات CPM فة يتوقف عند نقطة isoelectric وطول فة37.
هذا في اختبار سيلولو يجب أن تجعل من الممكن لفرز الجزيئات التي يمكن أن يحتمل أن تعبر BBB قبل الاضطلاع الحرائك الدوائية وتحليل الدوائية في الحيوانات، ومن الناحية المثالية في نفس الوقت لتكون قادرة على التنبؤ بسلوكهم في الجهاز العصبي حمة. هذا النظام بيولوجيا ذات الصلة ويسهل إعداد والتعامل مع من مهنيين مدربين تدريبا جيدا في خلية ثقافة26،29،،من3038. الفائدة من هذا القبيل في اختبار سيلولو سيكون من شقين هما: خفض تكاليف الاختبارات الإكلينيكية من ناحية، والحد من استخدام اختبار الحيوانات من ناحية أخرى.
في هذه المقالة قد دللنا على كيفية بناء سيلولو في الدم/الدماغ واجهة, BBB-مينيبرين، من خلال الجمع بين نموذج BBB وثقافة مختلطة الدماغ الخلايا الدماغية (مينيبرين) في مجموعة واحدة. وهذا النظام بيولوجيا ذات الصلة، من السهل إعداد والمجربون مدربة تدريبا جيدا في خلية ثقافة للتعامل.
أما …
The authors have nothing to disclose.
هذه الدراسة وأيد بالمنح الداخلية من معهد باستور، بما في ذلك منحة إينسيتاتيفي (PTR 435) ومنحة قدمت “Contrat de مناصرة à la بحوث” سانوفي باستور لمعهد باستور. ) أ (دا كوستا وأيده منح شركة سانوفي-باستور وفلوريان باكا هو المستفيد منحة الدكتوراه المقدمة من ANRT (الرابطة الوطنية للبحوث وتكنولوجي de la). ونحن مدينون “العلاقات العامة” بيار أوليفييه كورو والدكتور ميلر فلورنسا لإجراء مناقشات مفيدة.
12 well plates | Corning | 3336 | |
5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
CMC | Calbiochem | 217274 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |