Un modelo de interfaz de sangre-cerebro humano estudiar cruces de barrera por patógenos o medicamentos y sus interacciones con el cerebro
Summary
Aquí presentamos un protocolo que describe la configuración de un cellulo en BBB (barrera hematoencefálica)-cultura de membrana porosa poliester Minibrain insertar sistema para evaluar el transporte de biomoléculas o agentes infecciosos a través de una BBB humana y sus impacto fisiológico en las células cerebrales vecinas.
Abstract
Principios de detección de medicamentos del sistema nervioso en un pertinente y confiable en el modelo de cellulo BBB para su penetración y su interacción con la barrera y el parénquima cerebral sigue siendo una necesidad insatisfecha. Para llenar este vacío, hemos diseñado un 2D en modelo de cellulo, BBB-Minibrain, mediante la combinación de una membrana porosa cultura inserto humano BBB modelo un Minibrain formado por una tri-cultura de células de cerebro humano (neuronas, astrocitos y células de la microglía) de poliéster. El BBB-Minibrain nos permitió probar el transporte de un candidato a fármaco neuroprotector (p. ej., Neurovita), a través de la BBB, para determinar la focalización específica de esta molécula a las neuronas y para mostrar que la propiedad neuroprotectora de la droga se conserva después de la droga había cruzado el BBB. También hemos demostrado que BBB-Minibrain constituye un interesante modelo para detectar el paso de las partículas del virus a través de la barrera de las células endoteliales y a controlar la infección de la Minibrain neuroinvasive partículas del virus. El BBB-Minibrain es un sistema fiable, fácil de manejar para investigador entrenado en la tecnología de cultivo celular y predictivo de los fenotipos de las células del cerebro después del tratamiento o insulto. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: introducción de derisking pasos temprano en el desarrollo de drogas en una mano y reducir el uso de animales en experimentación por otro lado.
Introduction
El cerebro se separa de la circulación sistémica por una estructura no-permeable que restringe los intercambios entre el parénquima del cerebro y la sangre, llamada barrera blood – brain (BBB). Compuesto principalmente de células endoteliales cerebrales, el BBB interactúa dinámicamente con astrocitos, microglía perivascular y las neuronas del parénquima cerebral vecino. Las tres funciones principales de la BBB son la creación y mantenimiento de la homeostasis iónica de funciones neuronales, fuente del cerebro con nutrientes y protección de lesiones tóxicas o entrada de agentes patógenos1,2, que contribuyen a el mantenimiento de la homeostasis del cerebro y sus funciones3. Esta barrera es tan eficiente que sólo algunas drogas pueden cruzar el BBB4,5. En la actualidad, los métodos disponibles para predecir si una molécula pasará el BBB y difusa en el cerebro consisten en ex vivo estudios sobre seguimiento de imagen material, autopsia del cerebro de voluntarios humanos por MRI (resonancia magnética) o PET (posición de emisión tomografía) o farmacodinámica y farmacocinética preclínica en animales6,7,8. Estas técnicas y modelos tienen algunas limitaciones, tales como la limitada resolución del PET y la baja sensibilidad de MRI6,8, la dificultad para cuantificar moléculas (es decir, moléculas de anticuerpo base por ejemplo) que mal penetrar el cerebro7, para la preclínica estudios y su alto costo y su complejo de pruebas en animales.
El último punto es importante porque, según el 3R reglas (reemplazo, reducción y refinamiento de los experimentos con animales) han pedido a las administraciones reguladoras que los investigadores urgentemente desarrollan científicamente correcta alternativa a animal experimentación9,10,11,12,13,14,la15.
En las últimas décadas, varios modelos in vitro de BBB han propuesto16,17,18 por cultivar en filtro de membrana inserta las células endoteliales de diferentes especies como el ratón, rata, bovino y cerdo. En cuanto a la especie humana, la escasa y difícil disponibilidad de células primarias incitó a los investigadores a desarrollar modelos humanos basados en las células endoteliales de cerebro inmortalizado o células madre procedentes de humanos19,20, 21. Estas barreras son adecuadas in vitro sustitutos de BBB que expresan marcadores de células endoteliales, marcadores de ensambladura apretada, transportadores de eflujo, portadores de soluto, receptores y responder a los estímulos endotelial 20. Se ensayaron algunos modelos BBB mediante filtro membrana insertos recubiertos con células endoteliales y otros tipos de células (es decir, astrocitos, neuronas o del22,del pericitos23,24). El objetivo de estas culturas Co fue aumentar las características físicas de BBB aprovechándose de la secreción de factores solubles por astrocitos/neuronas o del pericitos.
Sin embargo, ninguno de estos modelos incluye tejido cerebral para estudiar y predecir el destino de un candidato una vez ha pasado la barrera. Por lo tanto, nuestro objetivo era construir un cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y un cultivo de neuronas mezcladas en un solo equipo. El BBB-Minibrain utiliza un sistema de cultivo que consiste en un filtro poroso en un pozo de una placa de cultivo celular pocillos. El filtro está recubierto con células hCMEC/D3, una línea de células endoteliales del cerebro humano que ha demostrado ser altamente confiable para prueba25,26,27, para formar el BBB de la droga BBB. Minibrain, que es una cultura Co diferenciada de las neuronas humanas y astrocitos derivados de la NTera/Cl2.D1 de la célula línea28,29 mezclan junto con la línea de células microgliales humano CHME/Cl530 en proporción correspondiente a la microglia vs relaciones neurona-astrocitos del cerebro31, se cultiva en la parte inferior de la placa del bien.
Además de estudiar el pasaje de drogas a través de la BBB y su destino en el parénquima, el interfaz de sangre-cerebro en cellulo modelo podría ser una poderosa herramienta para abordar la entrada de patógenos en el cerebro (neuroinvasiveness), la dispersión en el cerebro (neurotropismo) y la toxicidad (neurovirulencia) puede ejercer sobre las células del parénquima cerebral. Neurovirulencia y neuroinvasiveness estudios benefician el desarrollo de un eficiente modelo de cellulo y ventajosa para reemplazar a los modelos animales. Usando el kit de BBB-Minibrain32, demostró el fenotipo neuroinvasive de raros mutantes virales que acumula en la cepa del virus neurotrópico francés del Virus de la fiebre amarilla (es decir, FNV-YFV33,34) para preparar un suspender la vacuna viva de YFV y el paso de una biomolécula neuroprotectivos y neuroprotectoras llamado Neurovita (referido como NV en adelante en el manuscrito)35. Porque NV ni naturalmente cruza la membrana celular ni el BBB, NV fue fundido con la parte variable (VHH) de anticuerpos de cadena única llama que atraviesa las membranas biológicas incluyendo la BBB y funciona como una célula penetrando molécula (CPM)36. La propiedad CPM de VHH parece depender del punto isoeléctrico y la longitud de los VHH37.
En prueba de cellulo debe hacerlo posible ordenar las moléculas que potencialmente podrían cruzar el BBB antes de realizar farmacocinética y farmacodinámica análisis en animales e idealmente en el mismo tiempo ser capaz de predecir su comportamiento nervioso parénquima. Este sistema es biológicamente relevante y fácil de configurar y manejar por profesionales bien formados en la célula cultura26,29,30,38. El interés de tales pruebas de cellulo sería doble: reducir los costos de ensayos preclínicos en la una mano y reducir el uso de pruebas en animales por otra parte.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este artículo hemos demostrado cómo construir una cellulo en interfaz de sangre, cerebro, BBB-Minibrain, combinando un modelo BBB y la cultura de mezcla cerebro células cerebrales (Minibrain) en un solo equipo. Este sistema es biológicamente relevante, fácil de configurar y manejar para experimentadores bien ensen $ ados en cultivo celular.
En cuanto a cualquier otro modelo in vitro de BBB, se obtendrían resultados confiables si se aplica el drástico control de la tirantez de la barr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por becas internas del Instituto Pasteur incluyendo una subvención de Incitative (PTR 435) y por una donación “Contrat de Soutien à la Recherche” de Sanofi Pasteur Institut Pasteur. A. da Costa fue apoyada por la concesión de Sanofi-Pasteur y Florian Bakoa es beneficiario de una beca de doctorado proporcionada por la ANRT (Asociación Nacional de la Recherche et de la Technologie). Estamos agradecidos a Pr Pierre-Olivier Couraud y Dr. Florencia Molinero por discusiones útiles.
Materials
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
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