병원 체 또는 의약품 및 두뇌와 그들의 상호 작용에 의해 장벽 횡단 연구를 인간의 혈액-뇌 인터페이스 모델
Summary
여기에 우리가 현재에 cellulo BBB (혈액 뇌 장벽)의 설정을 설명 하는 프로토콜-Minibrain 폴리에스터 다공성 막 문화 인간의 BBB에 걸쳐 생체 또는 전염 성 요원의 전송 평가 시스템 삽입 및 그들의 이웃 뇌 세포에 생리 적 영향입니다.
Abstract
초기에 관련 신 경계 의약품의 심사와 그들의 침투와 장벽와 뇌 실질의 상호 작용에 대 한 cellulo BBB 모델에서 신뢰할 수 있는 여전히 충족된 필요. 이 간격을 채우기 위해 우리는 폴 리 에스테 트라이-인간의 뇌 세포 (뉴런, 이다 microglial 세포)의 문화에 의해 형성 된 다공성 멤브레인 문화 삽입 인간의 BBB 모델은 Minibrain와 결합 하 여 BBB-Minibrain, cellulo 모델에서 2D 설계 되었습니다. BBB-Minibrain BBB, 뉴런에이 분자의 특정 대상으로 확인 하 고 약물의 신경 보호 속성 후 보존 되었다 표시를 통해 신경 보호 약물 후보 (예: Neurovita), 전송 테스트를 허용 약 BBB를 교차 했다. 우리 또한 그 BBB-Minibrain 내 피 세포 장벽을 가로질러 바이러스 입자의 흐름을 감지 하 고 neuroinvasive 바이러스 입자는 Minibrain의 감염을 모니터링 하는 재미 있는 모델을 구성 하는 설명 했다. BBB-Minibrain은 신뢰할 수 있는 시스템, 쉽게 치료 또는 모욕 후 연구원 셀 문화 기술에서 훈련 및 뇌 세포 고기의 예측에 대 한 처리. Cellulo 테스트 등의 관심은 두 가지 것: 소개 하는 한편 약물 개발의 초기 단계를 derisking 하 고 다른 한편으로 테스트 하는 동물의 사용을 줄이고.
Introduction
두뇌는 뇌 실질과 혈액-뇌 장벽 (BBB) 이라는 혈액의 교류를 제한 하는 비 투과성 구조에 의해 조직의 순환에서 분리 된다. 주로 대뇌 내 피 세포의 구성, BBB는 동적 이다, 혈관 주위 microglia 및 이웃 뇌 실질의 신경 상호 작용 합니다. BBB의 세 가지 주요 기능은 생성 및 유지 관리의 영양소와 독성 부상 방지와 뇌의 공급 또는 병원 체1,2에 공헌 하는 신경 기능에 대 한 이온 항상성 뇌 항상성 및 그 기능3의 유지 보수. 이 그래서 몇 가지 약물만 BBB4,5교차 수 있습니다 효율적입니다. 현재, 분자 BBB 통과 되며 뇌에 확산 여부를 예측 하기 위해 사용할 수 있는 방법을 ex vivo 연구 부검 소재, 이미지 추적 MRI (자기 공명 영상) 또는 애완 동물 (위치 방출에 의해 인간의 자원 봉사자의 두뇌에서에 구성 단층 촬영) 또는 pharmacodynamics와 동물6,,78pharmacokinetic 전 임상 연구. 이러한 기술 및 모델 애완 동물의 제한 된 해상도 MRI6,8, 분자 (즉, 예를 들어 항 체 기반 분자)는 가난 하 게 계량 하기 어려움의 낮은 감도 같은 몇 가지 한계를가지고 7뇌 관통 하 고는 전 임상에 대 한 그들의 높은 비용 및 동물 실험의 연구.
마지막 포인트는 3R의 규칙, (대체, 감소 및 동물 실험의 상세) 규제 행정 질문이 연구원은 급히 동물에 과학적으로 정확한 대안을 개발 하기 때문에 중요 한 실험9,10,11,12,13,,1415.
지난 수 십년 동안 여러 체 외 모델 BBB의 제안 되었습니다16,,1718 필터에 배양 하 여 막 마우스, 쥐, 소, 돼지 등 다른 종에서 내 피 세포를 삽입. 마찬가지로 지금까지 인류의 관한 1 차 셀의 부족 하 고 어려운 여부 메시지가 불멸 하 게 뇌 내 피 세포 또는 줄기 세포 인간 파생19,20, 기반 인체 모델을 개발 하는 연구원 21. 이러한 장벽을 BBB의 적절 한 생체 외에서 서로게이트는 내 피 세포 마커, 긴밀 접합 마커, 경과 전송기, 용 질 운반대, 수용 체, 표현 하 고 내 피 자극 20에 응답. 내 피 세포와 다른 세포 유형 (즉, 이다, 신경 또는 pericytes22,23,24) 코팅 필터 막 삽입을 사용 하 여 몇 가지 BBB 모델 분석 했다. 이러한 공동 문화의 목표 이다/신경 또는 pericytes 수용 성 요인의 분 비를 이용 하 여 BBB 물리적 특성을 증가 했다.
그럼에도 불구 하 고, 이러한 모델의 연구 하 고 장벽 통과 되 면 마약 후보자의 운명을 예측 뇌 실질을 포함 되어 있습니다. 따라서, 우리의 목표는에 cellulo를 건설 했다 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, 하나의 키트로 BBB 모델과 혼합된 뇌 세포의 문화를 결합 하 여. BBB-Minibrain multiwell 셀 문화 접시의 우물에 삽입 된 다공성 필터 구성 된 문화 시스템을 사용 합니다. 필터는 인간의 뇌 내 피 세포 선 BBB 약25,,2627, BBB를 테스트에 대 한 신뢰성이 입증 되었습니다 hCMEC/D3 셀으로 입힌 다. Minibrain, 인간의 뉴런의 공동 차별화 된 문화 그리고 이다 NTera/Cl2.D1 셀 선28,29 에서 파생 된 인간 microglial 셀 라인 함께 혼합 켐/Cl530 비율에 해당 하는 microglia31뇌 신경 이다 비율 대 접시의 바닥에 잘 재배 이다.
BBB와 그들의 운명은 실질에 약물의 통로 공부, 외 cellulo 모델에는 혈액-뇌 인터페이스 두뇌 (neuroinvasiveness), 뇌 (neurotropism)에 분산에 병원 체의 항목을 해결 하기 위해 강력한 도구가 될 수 있습니다. 그리고 그들은 뇌 실질 세포에 독성 (neurovirulence)을 발휘할 수 있다. Neurovirulence 및 neuroinvasiveness 연구는 효율적인 cellulo 모델에서의 개발에서 유익 하 고 대체 동물 모델을 것 이다. 우리 프랑스 Neurotropic 바이러스 스트레인 황열병 바이러스 (즉, FNV YFV33,34)의 준비 하는 데 사용에 드문 바이러스 돌연변이의 neuroinvasive 표현 형 시연 BBB-Minibrain 키트32를 사용 하는 라이브 YFV 백신과 neuroregenerative 및 신경 biomolecule 라는 Neurovita (라고 NV 이제 원고)35의 통행 중단. 때문에 네바다도 자연스럽 게 세포 막 십자가 BBB, NV BBB를 포함 하 여 생물 막 십자가 관통 분자 (CPM)36셀으로 라마의 단일 체인 항 체의 가변 부분 (VHH)와 융합 했다. CPM 속성의 VHH 전자 점과 VHH37의 길이에 의존 것으로 보인다.
Cellulo 테스트에서이 pharmacokinetic 수행 및 동물, 및 이상적으로 긴장에서 그들의 행동을 예측할 수 있을 것 같은 시간에 pharmacodynamics 분석 하기 전에 잠재적으로 BBB를 교차 수 있는 분자 정렬 가능 하 게 한다 실질입니다. 이 시스템은 생물학적으로 적절 하 고 쉽게 설정 하 고 셀 문화26,29,,3038에 잘 훈련 된 전문가 의해 처리. Cellulo 테스트에서 그러한 관심 두 배 것: 한 손으로 전 임상 시험의 비용을 절감 하 고 반면에 동물 실험의 사용을 줄이고.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 문서에서 우리는 cellulo을 구축 하는 방법을 시연 혈액/뇌 인터페이스, BBB-Minibrain, BBB 모델과의 문화를 결합 하 여 하나의 키트로 뇌 세포 (Minibrain) 뇌를 혼합. 이 시스템은 생물학으로 관련, 쉽게 설정 하 고 세포 배양에서 잘 훈련 된 경험에 대 한 처리.
BBB의 다른 어떤 생체 외에서 모델에 관해서는 장벽의 견고의 과감 한 제어 적용 되는 경우 신뢰할 수 있는 결과 얻을 것 이…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 사노 피 파스퇴르 파스퇴르에 의해 Incitative 그랜트 (PTR 435)를 포함 하 여 파스퇴르에서 내부 교부 금에 의해 및 “성립 드 지원 à 라 검색” 제공 된 교부 금에 의해 지원 되었다. A. 다 코스타는 사노 피-파스퇴르 그랜트와 플로리안 Bakoa에 의해 지원 되었다는 ANRT에서 제공 하는 박사 학위 부여의 (협회 국립 드 라 검색 외 드 라 Technologie). 우리는 유용한 토론에 대 한 홍보 피에르 올리비에 Couraud와 박사 피렌체 밀러에 빚을입니다.
Materials
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
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