Een Model Interface menselijke Blood-Brain barrière kruisingen door ziekteverwekkers of geneesmiddelen en hun interacties met de hersenen bestuderen
Summary
Hier presenteren we een protocol met een beschrijving van de instelling van een in gnudles BBB (bloed-hersenbarrière)-Minibrain polyester poreuze membraan cultuur invoegen systeem teneinde het vervoer van biomoleculen of infectieuze agentia via een menselijke BBB en hun fysiologische effect op de naburige hersencellen.
Abstract
De vroege screening van zenuwstelsel geneesmiddelen op een relevante en betrouwbare in gnudles BBB model voor hun penetratie en hun interactie met de barrière en de hersenen parenchym is nog steeds een unmet behoefte. Om te vullen deze kloof, ontwierpen we een 2D in gnudles model, de BBB-Minibrain, door het combineren van een polyester poreuze membraan cultuur invoegen menselijke BBB model met een Minibrain gevormd door een tri-cultuur van menselijke hersencellen (neuronen, astrocyten en microglial cellen). De BBB-Minibrain ons in staat gesteld om te testen het vervoer van een neuroprotectieve drug kandidaat (bijvoorbeeld Neurovita), via de BBB, om te bepalen van de specifieke doelgerichtheid van deze molecule tot neuronen en om te laten zien dat het neuroprotectieve eigendom van de drug werd bewaard na de drug had stak de BBB. We hebben ook aangetoond dat BBB-Minibrain een interessant model vormt voor de passage van virusdeeltjes detecteren in de endotheliale cellen barrière en het controleren van de infectie van de Minibrain door neuroinvasive virusdeeltjes. De BBB-Minibrain is een betrouwbaar systeem, makkelijk te hanteren voor onderzoeker opgeleid in cel-cultuur technologie en voorspellende van de hersenen cellen fenotypen na behandeling of belediging. De belangstelling voor dergelijke gnudles testen zou tweeledig: introductie van derisking stappen in het begin van de Geneesmiddelenontwikkeling enerzijds en vermindering van het gebruik van dierproeven aan de andere kant.
Introduction
De hersenen wordt gescheiden van de systemische circulatie door een niet-poreuze structuur die uitwisselingen tussen de hersenen parenchym en het bloed beperkt, de bloed – hersenbarrière (BBB) genoemd. Voornamelijk samengesteld uit cerebrale endotheliale cellen, interageert de BBB dynamisch met astrocyten, gerelateerde microglia en neuronen van de naburige hersenen parenchym. De drie belangrijkste functies van de BBB zijn het aanleggen en bijhouden van Ionische homeostase voor neuronale functies, levering van de hersenen met voedingsstoffen, en bescherming tegen toxische verwondingen of vermelding van ziekteverwekkers1,2, die bijdragen tot het onderhoud van de hersenen homeostase en haar functies3. Deze barrière is zo efficiënt dat slechts enkele geneesmiddelen de BBB4,5 kruisen kunnen. Op dit moment bestaan de beschikbare methoden om te voorspellen of een molecuul zal de BBB passeren en diffuus in de hersenen uit ex vivo studies over autopsie materiaal, afbeelding bijhouden in de hersenen van menselijke vrijwilligers door MRI (magnetic resonance imaging) of huisdier (positie emissie tomografie) of farmacodynamica en farmacokinetische Preklinische studies in dieren6,7,8. Deze technieken en modellen hebben enkele beperkingen, zoals de beperkte resolutie van PET en de lage gevoeligheid van MRI6,8, de moeilijkheid om het kwantificeren van moleculen (dat wil zeggen, gebaseerd antilichamenmolecules bijvoorbeeld) dat slecht de hersenen7doordringen, en voor de preklinische studies hun hoge kosten en resort van dierproeven.
Het laatste punt is belangrijk omdat, volgens de 3R’s regels, (vervanging, vermindering en verfijning van dierproeven) de regelgevende instanties hebben gevraagd dat de onderzoekers dringend wetenschappelijk accuraat alternatief voor dier ontwikkelen experimenten9,10,11,12,13,14,15.
In de afgelopen decennia verschillende in-vitro modellen van BBB heeft voorgesteld16,17,18 cultiveren op filter membraan voegt endotheliale cellen van verschillende soorten zoals muis, rat, runderen en varkens. Wat betreft de menselijke soort is, de beschikbaarheid van het schaars en moeilijk van primaire cellen gevraagd de onderzoekers te ontwikkelen van menselijke modellen op basis van vereeuwigd hersenen endotheliale cellen of cellen van de stam van de mens-afgeleide19,20, 21. Deze belemmeringen zijn goede in-vitro surrogaten van BBB mits ze express endothelial cel markeringen, strakke junction markeringen, efflux vervoerders, opgeloste vervoerders, receptoren, en te reageren op het endotheel stimuli 20. Een paar BBB modellen met behulp van de filter membraan inzetstukken bekleed met endotheliale cellen en andere celtypen (dat wil zeggen, astrocyten, neuronen of pericytes22,23,24) werden bepaald. Het doel van deze mede culturen was te verhogen van de fysieke kenmerken van BBB door te profiteren van de secretie van oplosbare factoren door astrocyten/neuronen of pericytes.
Echter omvat geen van deze modellen hersenen parenchym om te studeren en voorspellen van het lot van een drug-kandidaat, zodra het de barrière is verstreken. Daarom, ons doel was om het bouwen van een in gnudles bloed/hersenen interface, de BBB-Minibrain, door het combineren van een BBB-model en een cultuur van gemengde hersencellen in een enkele kit. De BBB-Minibrain maakt gebruik van een cultuur-systeem dat bestaat uit een poreuze filter ingevoegd in een put van een multiwell cel cultuur plaat. Het filter is bekleed met cellen van de hCMEC/D3, een menselijk brein endothelial cellijn, die heeft bewezen zeer betrouwbaar voor BBB drugstests25,26,27, om te vormen van de BBB. De Minibrain, die een co gedifferentieerde cultuur van menselijke neuronen en astrocyten afgeleid van de NTera/Cl2.D1 cel lijn28,29 gemengd samen met de menselijke microglial cellijn CHME/Cl530 in verhouding overeenkomt met de Microglia vs. neuron-astrocyten ratio’s van de hersenen31, wordt gekweekt in de bodem van de plaat goed.
Naast het bestuderen van passage van drugs over de BBB en hun lot in de parenchym, zou de blood-brain-interface in gnudles model een krachtig hulpmiddel om de vermelding van ziekteverwekkers in de hersenen (neuroinvasiveness), de spreiding in de hersenen (neurotropisme) en de toxiciteit (neurovirulence) zij op parenchym hersencellen uitoefenen kunnen. Neurovirulence en neuroinvasiveness studies zou profiteren van de ontwikkeling van een efficiënt in gnudles model en nuttig zijn, ter vervanging van diermodellen. Met behulp van de BBB-Minibrain kit32, wij laten zien dat het fenotype van de neuroinvasive van zeldzame virale mutanten die verzameld in de Franse neurotrope virusstam van gele koorts-Virus (dat wil zeggen, FNV-YFV33,34) gebruikt om te bereiden een levend YFV vaccin en de passage van een neuroregenerative en neuroprotectieve Biomolecuul genaamd Neurovita (aangeduid als NV voortaan in het manuscript)35stopgezet. Omdat NV noch natuurlijk kruist de celmembraan noch de BBB, NV werd gefuseerd met het variabele gedeelte (VHH) van een één keten antilichamen van Lama die kruist de biologische membranen met inbegrip van de BBB en fungeert als een cel penetrerende molecuul (CPM)36. De eigenschap CPM van VHH lijkt te zijn afhankelijk van het elektrisch punt en de lengte van de VHH37.
Dit in gnudles test moet het mogelijk maken te sorteren van de moleculen die potentieel van de BBB vóór het uitvoeren van de farmacokinetische en farmacodynamica analyse in dieren, en idealiter in de zelfde tijd oversteken kon te kunnen voorspellen hun gedrag in het zenuwstelsel Parenchym. Dit systeem is biologisch relevant en vlot voor troep opwaarts en verwerken door professionals die goed getraind in cel cultuur26,29,30,38. De belangstelling voor dergelijke gnudles testen zou tweeledig: vermindering van de kosten van preklinische proeven aan de ene kant en het verminderen van het gebruik van dierproeven aan de andere kant.
Protocol
Representative Results
Discussion
In dit artikel we laten zien hoe het bouwen van een in gnudles bloed/hersenen interface, de BBB-Minibrain, door het combineren van een BBB-model en een cultuur van gemengd hersenen cerebrale cellen (Minibrain) in een enkele kit. Dit systeem is biologisch relevant, eenvoudig te installeren en te verwerken voor onderzoekers goed getraind in celkweek.
Zoals voor elke andere in vitro model van BBB, kunnen betrouwbare resultaten worden verkregen als drastische controle van de luchtdichtheid van de …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door interne subsidies uit Institut Pasteur met inbegrip van een Incitative subsidie (PTR-435) en een subsidie “Contrat de Soutien à la Recherche” geboden door Sanofi Pasteur aan het Institut Pasteur. A. da Costa werd gesteund door de Sanofi Pasteur grant en Florian Bakoa is de ontvanger van een subsidie van de PhD geboden door de ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). We zijn dank verschuldigd aan Pr Pierre-Olivier Couraud en Dr Florence Miller voor nuttige discussies.
Materials
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
- Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
- Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
- Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
- Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
- Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
- Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
- Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
- Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
- Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
- Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
- Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
- Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
- da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
- Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , (2014).
- Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
- Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
- Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , (2011).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
- Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
- Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
- Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
- Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).
