Summary

एक मानव रक्त मस्तिष्क इंटरफेस मॉडल रोगजनकों या दवाओं और मस्तिष्क के साथ उनकी बातचीत द्वारा बैरियर क्रॉसिंग का अध्ययन करने के लिए

Published: April 09, 2019
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Summary

यहां हम एक cellulo bbb (रक्त मस्तिष्क बाधा) में एक की स्थापना का वर्णन प्रोटोकॉल वर्तमान-minibrain पॉलिएस्टर झरवाला झिल्ली संस्कृति डालने प्रणाली आदेश में जैव अणुओं या एक मानव bbb भर में संक्रामक एजेंटों के परिवहन का मूल्यांकन करने के लिए और उनके पड़ोसी मस्तिष्क कोशिकाओं पर शारीरिक प्रभाव ।

Abstract

एक प्रासंगिक और cellulo bbb मॉडल में उनकी पैठ और बाधा और मस्तिष्क पैरेन्काइमा के साथ उनकी बातचीत के लिए एक उचित और विश्वसनीय पर तंत्रिका तंत्र दवाओं की जल्दी स्क्रीनिंग अभी भी एक अपूरित की जरूरत है । इस अंतर को भरने के लिए, हम cellulo मॉडल में एक 2D डिजाइन, BBB-Minibrain, एक पॉलिएस्टर झरनी झिल्ली संस्कृति एक त्रिकोणीय मानव मस्तिष्क कोशिकाओं (ंयूरॉंस, astrocytes और microglial कोशिकाओं की संस्कृति द्वारा गठित Minibrain के साथ मानव BBB मॉडल डालने के संयोजन के द्वारा) । Bbb-minibrain हमें एक न्यूरोप्रोटेक्टिव दवा उंमीदवार (जैसे, neurovita) के परिवहन का परीक्षण करने की अनुमति दी, bbb के माध्यम से, न्यूरॉन्स के लिए इस अणु के विशिष्ट लक्ष्यीकरण निर्धारित करने के लिए और दिखाने के लिए कि दवा की न्यूरोप्रोटेक्टिव संपत्ति के बाद संरक्षित किया गया था दवा बीबीबी को पार कर गई थी । हम यह भी दिखा दिया है कि BBB-Minibrain एक दिलचस्प मॉडल endothelial कोशिकाओं बाधा भर में वायरस के कणों के पारित होने का पता लगाने और न्यूरोइनवेसिव वायरस कणों द्वारा Minibrain के संक्रमण की निगरानी करने के लिए गठन किया है । BBB-Minibrain एक विश्वसनीय प्रणाली, सेल संस्कृति प्रौद्योगिकी और उपचार या अपमान के बाद मस्तिष्क कोशिकाओं phenotypes के भविष्य कहनेवाला में प्रशिक्षित शोधकर्ता के लिए संभालना आसान है । इस तरह के cellulo परीक्षण में ब्याज twofold होगा: एक हाथ पर दवा के विकास में जल्दी कदम derisking शुरू करने और दूसरी ओर पशु परीक्षण के उपयोग को कम करने ।

Introduction

मस्तिष्क एक गैर पारगम्य संरचना है कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा और रक्त, रक्त मस्तिष्क बाधा (BBB) कहा जाता है के बीच आदान प्रदान प्रतिबंधित द्वारा प्रणालीगत संचलन से अलग है । ज्यादातर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं से बना है, BBB गतिशील astrocytes, परिसंवहनी microglia और पड़ोसी मस्तिष्क पैरेन्काइमा के ंयूरॉंस के साथ सूचना का आदान प्रदान । Bbb के तीन प्रमुख कार्यों के निर्माण और न्यूरोनल कार्यों के लिए आयनिक homeostasis के रखरखाव, पोषक तत्वों के साथ मस्तिष्क की आपूर्ति कर रहे हैं, और विषाक्त चोटों या रोगजनकों1,2के प्रवेश से सुरक्षा, जो योगदान करने के लिए मस्तिष्क होमियोस्टैसिस और उसके कार्यों के रखरखाव3। इस बाधा इतना कुशल है कि केवल कुछ दवाओं bbb4,5को पार कर सकते हैं । वर्तमान में, उपलब्ध तरीकों की भविष्यवाणी करने के लिए कि क्या एक अणु BBB पास होगा और मस्तिष्क में फैलाना पूर्व vivo अध्ययन से मिलकर बनता है ऑटोप्सी सामग्री, एमआरआई द्वारा मानव स्वयंसेवकों के मस्तिष्क में छवि ट्रैकिंग (चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग) या पीईटी (positon उत्सर्जन tomography) या फार्माकोडाइनेमिक्स और पशुओं में फार्माकोकाइनेटिक पूर्व नैदानिक अध्ययन6,7,8. इन तकनीकों और मॉडलों जैसे पीईटी के सीमित संकल्प और एमआरआई6,8की कम संवेदनशीलता के रूप में कुछ सीमाएं हैं, कठिनाई अणुओं यों तो करने के लिए (यानी, उदाहरण के लिए एंटीबॉडी आधारित अणुओं) कि खराब 7मस्तिष्क घुसना, और पूर्व नैदानिक अध्ययन उनके उच्च लागत और पशु परीक्षण के रिसॉर्ट के लिए ।

अंतिम बिंदु महत्वपूर्ण है क्योंकि, है 3R’s नियमों के अनुसार, (प्रतिस्थापन, कमी और शोधन के पशु परीक्षण) विनियामक प्रशासन कहा है कि शोधकर्ताओं ने तुरंत वैज्ञानिक पशु के लिए सही विकल्प विकसित प्रयोग9,10,11,12,13,14,15.

पिछले दशकों में, bbb के विट्रो मॉडलों में कई का प्रस्ताव किया गया है16,17,18 फिल्टर झिल्ली पर खेती द्वारा ऐसी माउस, चूहा, गोजातीय और सुअर के रूप में विभिंन प्रजातियों से endothelial कोशिकाओं को संमिलित करता है । जहां तक मानव प्रजाति का संबंध है, प्राथमिक कोशिकाओं की दुर्लभ और कठिन उपलब्धता ने शोधकर्ताओं को मानव मॉडल को अमर मस्तिष्क endothelial कोशिकाओं या मानव व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के आधार पर विकसित करने के लिए प्रेरित किया19,20, 21. इन बाधाओं के विट्रो में उचित bbb के surrogates है बशर्ते कि वे endothelial सेल मार्करों, तंग जंक्शन मार्करों, बहि: स्राव ट्रांसपोर्टरों, घुला वाहक, रिसेप्टर्स, और endothelial उत्तेजनाओं 20का जवाब व्यक्त करते हैं । कुछ bbb मॉडल endothelial कोशिकाओं और अंय सेल प्रकार (यानी, astrocytes, ंयूरॉंस या pericytes22,23,24) के साथ लेपित फिल्टर झिल्ली आवेषण का उपयोग कर रहे थे assayed । इन सह संस्कृतियों का लक्ष्य astrocytes/ंयूरॉंस या pericytes द्वारा घुलनशील कारकों के स्राव का लाभ लेने के द्वारा BBB शारीरिक विशेषताओं को बढ़ाने के लिए किया गया था ।

फिर भी, इन मॉडलों में से कोई भी शामिल है मस्तिष्क पैरेन्काइमा का अध्ययन करने के लिए और एक दवा उंमीदवार के भाग्य की भविष्यवाणी एक बार यह बाधा पारित कर दिया है । इसलिए, हमारे लक्ष्य के लिए एक एक किट में एक BBB मॉडल और मिश्रित मस्तिष्क कोशिकाओं की एक संस्कृति के संयोजन से cellulo रक्त/मस्तिष्क अंतरफलक, BBB-Minibrain में एक का निर्माण किया गया था । BBB-Minibrain एक संस्कृति एक multiwell सेल संस्कृति प्लेट की एक अच्छी तरह से डाला फिल्टर से मिलकर प्रणाली का उपयोग करता है । फिल्टर hcmec/D3 कोशिकाओं, एक मानव मस्तिष्क endothelial कोशिका लाइन है कि bbb दवा परीक्षण25,26,27के लिए अत्यधिक विश्वसनीय साबित कर दिया गया है के साथ लेपित है, bbb के रूप में । मिनिब्रेन, जो मानव ंयूरॉंस और astrocytes की एक सह-विभेदित संस्कृति ntera/ब्स2. D1 सेल लाइन28,29 के साथ मिश्रित मानव माइक्रोग्लाइकल सेल लाइन के साथ मिला है chme/Cl530 के अनुरूप अनुपात में माइक्रोग्लिया बनाम ंयूरून-31मस्तिष्क के astrocytes अनुपात, थाली के तल में अच्छी तरह से खेती की जाती है ।

BBB भर में दवाओं के पारित होने के अलावा और उनके भाग्य में पैरेन्काइमा, रक्त मस्तिष्क अंतरफलक cellulo मॉडल में मस्तिष्क में रोगजनकों के प्रवेश का पता करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण हो सकता है (neuroinvasiveness), मस्तिष्क में फैलाव (neurotropism) और विषाक्तता (neurovirulence) वे मस्तिष्क पैरेन्काइमा कोशिकाओं पर डालती कर सकते हैं । Neurovirulence और neurovirulence अध्ययन cellulo मॉडल में एक कुशल के विकास से लाभ और पशु मॉडल की जगह लाभप्रद होगा । Bbb-minibrain किट३२का उपयोग कर, हम दुर्लभ वायरल म्यूटेंट कि पीले बुखार वायरस (यानी, fnv-yfv३३,३४) के फ्रेंच न्यूरोट्रॉपिक वायरस तनाव में जमा की neuroinvasive phenotype का प्रदर्शन एक तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया बंद रहते yfv वैक्सीन और एक neuroregenerative और न्यूरोप्रोटेक्टिव biomolecule बुलाया neurovita के पारित होने (NV के रूप में पांडुलिपि में अब से कहा जाता है)३५। क्योंकि NV न तो स्वाभाविक रूप से कोशिका झिल्ली को पार करता है और न ही BBB, NV एक एकल श्रृंखला Llama कि BBB और एक कोशिका मर्मज्ञ अणु (सीपीएम)३६के रूप में कार्य सहित जैविक झिल्ली को पार की एंटीबॉडी के चर भाग (vhh) के साथ जुड़े हुए थे । Vhh के सीपीएम संपत्ति समविभव बिंदु और vhh३७की लंबाई पर निर्भर लगता है ।

यह cellulo परीक्षण में यह संभव है कि अणुओं को बाहर ले जाने से पहले संभावित BBB को पार कर सकता है, और एक ही समय में आदर्श के लिए अपने व्यवहार की भविष्यवाणी करने में सक्षम होने के लिए कर सकते है पैरेन्काइमा. इस प्रणाली को जैविक रूप से प्रासंगिक है और आसानी से स्थापित और सेल संस्कृति26,29,30,३८में प्रशिक्षित पेशेवरों द्वारा संभाल आसान है । ऐसे cellulo परीक्षण में ब्याज दो गुना होगा: एक हाथ पर पूर्व नैदानिक परीक्षणों की लागत को कम करने और दूसरी ओर पशु परीक्षण के उपयोग को कम करने ।

Protocol

1. Ntera के सेल संस्कृति काम/ब्स2 । डी 1 के बाद मिटिक hNeurons और hAstrocytes के एक सह संस्कृति तैयार करने के लिए (NT2-N/ नोट: यह Minibrain के घटक है (चित्रा 1). Ntera/ब्स2. D1 तरल नाइट्रोजन टैंक से जमे हुए कोशिकाओं क?…

Representative Results

BBB-Minibrain रक्त मस्तिष्क अंतरफलक के cellulo प्रयोगात्मक मॉडल में एक है । BBB-Minibrain पॉलिएस्टर झिल्ली संस्कृति डालने प्रणाली पर ऊपरी स्तर पर एक रक्त डिब्बे और रक्त मस्तिष्क अ…

Discussion

इस अनुच्छेद में हम कैसे cellulo रक्त में एक बनाने के लिए प्रदर्शन/मस्तिष्क अंतरफलक, BBB-Minibrain, एक BBB मॉडल और मिश्रित मस्तिष्क मस्तिष्क कोशिकाओं (Minibrain) की एक संस्कृति के संयोजन से एक किट में । इस प्रणाली को जैविक रूप …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

इस अध्ययन Institut Pasteur से आंतरिक अनुदान द्वारा एक Incitative अनुदान (PTR ४३५) और एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था “Contrat de सौटीन à ला Recherche” Sanofi Pasteur द्वारा प्रदान करने के लिए Institut Pasteur । ए दा कोस्टा Sanofi द्वारा समर्थित-पाश्चर अनुदान और फ्लोरियन Bakoa एक पीएचडी ANRT द्वारा प्रदान की अनुदान के प्राप्तकर्ता है (एसोसिएशन Nationale डे ला Recherche एट डे ला Technologie) । हम उपयोगी चर्चाओं के लिए पीआर पियरे-ओलिवियर कौराउड और डॉ फ्लोरेंस मिलर के ऋणी हैं ।

Materials

12 well plates Corning 3336
5-fluoro-2’deoxyuridine Merck-Sigma Aldrich F0503
85mm Petri Dish Sarstedt 83-3902-500
Anti-Nf200 Merck-Sigma Aldrich N4142
β-mercapto-ethanol Merck-Sigma Aldrich M3148
CHME/Cl5 Unité de Neuroimmunologie Virale On request to Dr Lafon
CMC Calbiochem 217274
Cytosine β-D-arabinofuranoside Merck-Sigma Aldrich C1768
Dark 96 well plates Corning 3915
DMEM F12 Thermofisher Scientific 31330-038
DMSO Merck-Sigma Aldrich D2650
Endogro IV Millipore SCME004 endothelial cell medium
Ethanol Carlo Erba 529121
FBS Hyclone SV30015-04
Formaldehyde Merck-Sigma Aldrich 252549
GIEMSA RAL Diagnostic 320310
Goat-Anti Mouse Jackson Immuno Research 115-545-003
Goat-Anti Rabbit Thermofisher Scientific R37117
HBSS with Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14025-100
hCMEC/D3 Cedarlane CLU512
Hepes 1M Thermofisher Scientific 15630-070
Hoescht 33342 Merck-Sigma Aldrich 33263
Laminine Merck-Sigma Aldrich L6274
L-glutamin Thermofisher Scientific 25030-024
Lucifer Yellow Merck-Sigma Aldrich L0259
MEM 10X Thermofisher Scientific 21430
MEM 1X Thermofisher Scientific 42360
Ntera/Cl2D.1 ATCC CRL-1973
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 15714
PBS without Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14190
PBS-Ca2+-Mg2+ Thermofisher Scientific 14040-091
Pen/Strep Eurobio CXXPES00-07
Poly-d-Lysine Merck-Sigma Aldrich P1149
Prolong Gold Thermofisher Scientific P36930
Qiashredder QIAGEN 79656
Rat Collagen I Cultrex 3443-100-01
Retinoic Acid All-Trans Merck-Sigma Aldrich R2625
RNA purification kit QIAGEN 74104
SDS Merck-Sigma Aldrich L4509
Sodium bicarbonate 5.6% Eurobio CXXBIC00-07
Sodium Pyruvate Thermofisher Scientific 11360
T75 Cell+ Flask Sarstedt 83-1813-302 Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells
Transwell Corning 3460 polyester porous membrane culture inserts
Trypsin-EDTA Merck-Sigma Aldrich T3924
Ultra Pure Water Thermofisher Scientific 10977-035
Uridine Merck-Sigma Aldrich U3750
Versene Thermofisher Scientific 15040-033 EDTA
YFV-FNV IP Dakar Vaccine vial

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da Costa, A., Prehaud, C., Bakoa, F., Afonso, P., Ceccaldi, P., Lafaye, P., Lafon, M. A Human Blood-Brain Interface Model to Study Barrier Crossings by Pathogens or Medicines and Their Interactions with the Brain. J. Vis. Exp. (146), e59220, doi:10.3791/59220 (2019).

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