En menneskelig blod-hjerne-grensesnitt modell å studere barriere kryssinger av patogener eller medisiner og deres samhandling med hjernen
Summary
Her presenterer vi en protokoll som beskriver innstillingen for en i cellulo BBB (blod-hjernebarrieren)-Minibrain polyester porøs membran kultur sette system for å vurdere transport av biomolecules eller smittsomme stoffer over en menneskelig BBB og deres fysiologisk effekt på nærliggende hjernecellene.
Abstract
Tidlig screening nervesystemet legemidler på en relevant og pålitelige i cellulo BBB modell for gjennomtrenging og deres samspill med barrieren og hjernen parenchyma er fortsatt et udekket behov. For å fylle dette gapet, utviklet vi et 2D i cellulo modell, BBB-Minibrain, ved å kombinere en polyester porøs membran kultur sett inn menneskelige BBB modell med en Minibrain dannet av en tri-kultur for menneskelige hjerneceller (nevroner, astrocyttene og microglial celler). BBB-Minibrain tillatt oss å teste transport av neuroprotective stoffet kandidat (f.eks Neurovita), gjennom BBB, til å finne bestemte målretting av dette molekylet til neurons og viser at egenskapen neuroprotective av stoffet ble bevart etter stoffet hadde krysset BBB. Vi har også vist at BBB-Minibrain utgjør en interessant modell for å oppdage passering av viruspartikler over endotelceller barrieren og overvåke infeksjon av Minibrain av neuroinvasive viruspartikler. BBB-Minibrain er et pålitelig system, lett å håndtere for forsker utdannet i celle kultur teknologi og prediktiv av hjernen cellene fenotyper etter behandling eller fornærmelse. Interessen for slike cellulo testing ville være todelt: derisking trinnene tidlig i narkotika-utvikling på den ene siden og reduserer bruken av dyreforsøk derimot.
Introduction
Hjernen er separert fra systemisk sirkulasjonen av en ikke-permeable struktur som begrenser utveksling mellom hjernen parenchyma og blodet, kalles blod – hjerne barrieren (BBB). Meste består av cerebral endotelceller, samhandler BBB dynamisk med astrocyttene, perivascular microglia og nevroner i de nærliggende hjernen parenchyma. De tre store funksjonene i BBB er etablering og vedlikehold av ionisk homeostase for neuronal funksjoner, tilførsel av hjernen med næringsstoffer og beskyttelse fra giftige skader eller oppføring av patogener1,2, som bidrar til vedlikehold av hjernen homeostase og dens funksjoner3. Denne barrieren er så effektiv at bare noen medikamenter kan krysse BBB4,5. I dag er består de tilgjengelige metodene til å forutsi om et molekyl vil passere BBB og diffuse i hjernen av ex vivo studier på obduksjonen materiale, bilde sporing i hjernen av frivillige MRI (magnetisk resonans imaging) eller PET (posisjon utslipp tomografi) eller pharmacodynamics og farmakokinetiske prekliniske studier i dyr6,7,8. Disse teknikker og modeller har noen begrensninger, som begrenset oppløsningen av PET og lav følsomheten til Mr6,8, er vanskelig å kvantifisere molekyler (dvs. antistoff basert molekyler for eksempel) som dårlig trenge hjernen7, og for de prekliniske studier deres høye kostnader og feriestedet dyreforsøk.
Det siste punktet er viktig fordi 3R reglene, (erstatning, reduksjon og avgrensningen av dyreforsøk) de regulatoriske administrasjonene har spurt at forskerne raskt utvikle vitenskapelig nøyaktig alternativ til dyr eksperimentering9,10,11,12,13,14,15.
De siste tiårene, flere i vitro modeller av BBB har blitt foreslått16,17,18 av dyrking på filteret membran setter endotelceller fra ulike arter som mus, rotte, storfe og gris. Så langt som er opptatt av den menneskelige arten, bedt knappe og vanskelig anvendeligheten primære celler forskerne å utvikle human modeller basert på udødeliggjort hjernen endotelceller eller menneske-avledet stilk celler19,20, 21. Disse barrierene er riktig i vitro surrogater av BBB forutsatt at de uttrykker endothelial celle markører, tett krysset markører, middelklasseinnbyggere transportører, stoff bærere, reseptorer, og svare på endothelial stimuli 20. Noen BBB modeller bruker filteret membran setter belagt med endotelceller og andre celletyper (dvs. astrocyttene, nerveceller eller pericytes22,23,24) var assayed. Målet med disse co kulturer var å øke BBB kjennetegn ved å utnytte utskillelsen av løselig faktorer av astrocyttene/nerveceller eller pericytes.
Likevel inkluderer ingen av disse modellene hjernen parenchyma å studere og forutsi skjebnen til et medikament kandidat når det har gått barrieren. Derfor vårt mål var å bygge en i cellulo blod/hjernen grensesnitt, BBB-Minibrain, ved å kombinere en BBB modell og en kultur for blandet hjerneceller i et enkelt kit. BBB-Minibrain bruker en kultur-systemet består av et porøst filter i et godt av en multiwell celle kultur plate. Filteret er belagt med hCMEC/D3 celler, en menneskelig hjerne endothelial celle linje som har vist seg pålitelig for BBB narkotikatesting25,26,27, til BBB. Minibrain, som er en co differensiert kultur for menneskelig nevroner og astrocyttene avledet fra NTera/Cl2.D1 celle linje28,29 blandet sammen med menneskelige microglial celle linjen CHME/Cl530 forholdet tilsvarer den Microglia vs Nevron-astrocyttene prosenter av hjernen31, er dyrket i bunnen av platen godt.
I tillegg til å studere passering av narkotika over BBB og deres skjebne i parenchyma, kan blod-hjerne-grensesnitt i cellulo modell være et kraftig verktøy for å ta oppføring av patogener i hjernen (neuroinvasiveness), spredning i hjernen (neurotropism) og toksisitet (neurovirulence) de kan øve på parenchyma hjerneceller. Neurovirulence og neuroinvasiveness studier ville ha nytte av en effektiv i cellulo modellen utvikling og være en fordel å erstatte dyremodeller. Bruker de BBB-Minibrain kit32, vi viste neuroinvasive fenotypen av sjeldne viral mutanter som akkumulert i fransk Neurotropic virus belastningen av gulfeber viruset (dvs. FNV-YFV33,34) brukes til å forberede en avviklet live YFV vaksine og passering av en neuroregenerative og neuroprotective biomolecule kalt Neurovita (referert som NV heretter i manuskriptet)35. Fordi NV verken naturlig krysser cellemembranen eller BBB, NV var smeltet sammen med den variable delen (VHH) et enkelt kjede antistoff av Llama som krysser biologiske membraner inkludert BBB og fungerer som en celle gjennomtrengende molekyl (CPM)36. Egenskapen CPM for VHH synes å avhengige isoelectric punktet og lengden på VHH37.
Dette cellulo test bør gjør det mulig å sortere molekylene som potensielt kunne krysse BBB før gjennomføring farmakokinetiske og pharmacodynamics analyse i dyr, og samtidig kunne forutsi deres atferd i nervøse parenchyma. Dette systemet er biologisk relevant og enkelt å sette opp og håndtere av profesjonelle godt trent i cellen, kultur,26,,29,,30,,38. Interessen for slike cellulo testing ville være todelt: å redusere kostnadene ved prekliniske tester på den ene siden og redusere bruken av dyreforsøk derimot.
Protocol
Representative Results
Discussion
I denne artikkelen vi viste hvordan å bygge en i cellulo blod/hjernen grensesnitt, BBB-Minibrain, ved å kombinere en BBB modell og en blandet hjernen cerebral celler (Minibrain) i en enkelt kit. Dette systemet er biologisk relevant, enkel å sette opp og håndtere for forskere godt trent i cellekultur.
Som for alle andre i vitro modell av BBB, ville pålitelige resultater oppnås hvis drastisk kontroll av tetthet av barrieren. Setter inn bør testes nøye for permeabilitet og noen sett inn m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av interne tilskudd fra Institut Pasteur inkludert en Incitative grant (PTR 435) og stipend “Contrat de bra à la Recherche” gitt av Sanofi Pasteur til Institut Pasteur. A. da Costa ble støttet av Sanofi Pasteur grant og Florian Bakoa er mottaker av PhD stipend gitt av ANRT (Association Nationale de la Recherche et de la Technologie). Vi er gjeld til Pr Pierre-Olivier Couraud og Dr Florence Miller for nyttig diskusjoner.
Materials
| 12 well plates | Corning | 3336 | |
| 5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
| 85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
| Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
| β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
| CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
| CMC | Calbiochem | 217274 | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
| Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
| DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
| DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
| Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
| Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
| FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
| Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
| GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
| Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
| Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
| HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
| hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
| Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
| Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
| Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
| L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
| Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
| MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
| MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
| Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
| PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
| Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
| Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
| Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
| Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
| Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
| Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
| RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
| SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
| Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
| Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
| T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
| Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
| Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
| Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
| Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
| Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
| YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |
References
- Abbott, N. J., Patabendige, A. A., Dolman, D. E., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
- Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
- Iadecola, C. The Neurovascular Unit Coming of Age: A Journey through Neurovascular Coupling in Health and Disease. Neuron. 96 (1), 17-42 (2017).
- Bicker, J., Alves, G., Fortuna, A., Falcao, A. Blood-brain barrier models and their relevance for a successful development of CNS drug delivery systems: a review. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 87 (3), 409-432 (2014).
- Banks, W. A. From blood-brain barrier to blood-brain interface: new opportunities for CNS drug delivery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (4), 275-292 (2016).
- Montagne, A., et al. Brain imaging of neurovascular dysfunction in Alzheimer’s disease. Acta Neuropathologica. 131 (5), 687-707 (2016).
- Stanimirovic, D., Kemmerich, K., Haqqani, A. S., Farrington, G. K. Engineering and pharmacology of blood-brain barrier-permeable bispecific antibodies. Advances in Pharmacology. 71, 301-335 (2014).
- Albrecht, D. S., Granziera, C., Hooker, J. M., Loggia, M. L. In Vivo Imaging of Human Neuroinflammation. ACS Chemical Neuroscience. 7 (4), 470-483 (2016).
- Caloni, F., et al. Alternative methods: 3Rs, research and regulatory aspects. ALTEX. 30 (3), 378-380 (2013).
- Whittall, H. Information on the 3Rs in animal research publications is crucial. The American Journal of Bioethics. 9 (12), 60-61 (2009).
- Sneddon, L. U. Pain in laboratory animals: A possible confounding factor. Alternatives to Laboratory Animals. 45 (3), 161-164 (2017).
- Sneddon, L. U., Halsey, L. G., Bury, N. R. Considering aspects of the 3Rs principles within experimental animal biology. The Journal of Experimental Biology. 220, 3007-3016 (2017).
- Wells, D. J. Animal welfare and the 3Rs in European biomedical research. Annals of the New York Academy of Sciences. 1245, 14-16 (2011).
- Daneshian, M., et al. A framework program for the teaching of alternative methods (replacement, reduction, refinement) to animal experimentation. ALTEX. 28 (4), 341-352 (2011).
- Niemi, S. M., Davies, G. F. Animal Research, the 3Rs, and the "Internet of Things": Opportunities and Oversight in International Pharmaceutical Development. ILAR Journal. 57 (2), 246-253 (2016).
- Modarres, H. P., et al. In vitro models and systems for evaluating the dynamics of drug delivery to the healthy and diseased brain. Journal of Controlled Release. 273, 108-130 (2018).
- Jamieson, J. J., Searson, P. C., Gerecht, S. Engineering the human blood-brain barrier in vitro. Journal of Biological Engineering. 11, 37 (2017).
- Kaisar, M. A., et al. New experimental models of the blood-brain barrier for CNS drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 12 (1), 89-103 (2017).
- Aday, S., Cecchelli, R., Hallier-Vanuxeem, D., Dehouck, M. P., Ferreira, L. Stem Cell-Based Human Blood-Brain Barrier Models for Drug Discovery and Delivery. Trends in Biotechnology. 34 (5), 382-393 (2016).
- Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (5), 862-890 (2016).
- Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30 (8), 783-791 (2012).
- Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry International. 54 (3-4), 253-263 (2009).
- Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. Journal of Neuroscience Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
- Nakagawa, S., et al. Pericytes from brain microvessels strengthen the barrier integrity in primary cultures of rat brain endothelial cells. Cellular and Molecular Neurobiology. 27 (6), 687-694 (2007).
- Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmaceutics. 10 (1), 289-296 (2013).
- Weksler, B., Romero, I. A., Couraud, P. O. The hCMEC/D3 cell line as a model of the human blood brain barrier. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 16 (2013).
- Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB J. 19 (13), 1872-1874 (2005).
- Andrews, P. W. Retinoic acid induces neuronal differentiation of a cloned human embryonal carcinoma cell line in vitro. Developmental Biology. 103 (2), 285-293 (1984).
- Lafon, M., et al. Modulation of HLA-G expression in human neural cells after neurotropic viral infections. Journal of Virology. 79 (24), 15226-15237 (2005).
- Janabi, N., Peudenier, S., Heron, B., Ng, K. H., Tardieu, M. Establishment of human microglial cell lines after transfection of primary cultures of embryonic microglial cells with the SV40 large T antigen. Neuroscience Letters. 195 (2), 105-108 (1995).
- von Bartheld, C. S., Bahney, J., Herculano-Houzel, S. The search for true numbers of neurons and glial cells in the human brain: A review of 150 years of cell counting. The Journal of Comparative Neurology. 524 (18), 3865-3895 (2016).
- Prehaud, C., Lafon, M., Ceccaldi, P. E., Afonso, P., Lafaye, P. New in vitro Blood-Brain Barrier model. PCT. EP2015, 0706671 (2014).
- Holbrook, M. R., Li, L., Suderman, M. T., Wang, H., Barrett, A. D. The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Research. 69 (1), 31-39 (2000).
- da Costa, A., et al. Innovative in cellulo method as an alternative to in vivo neurovirulence test for the characterization and quality control of human live Yellow Fever virus vaccines: A pilot study. Biologicals. 53, 19-29 (2018).
- Prehaud, C., Lafon, M., Lafaye, P. Nanobodies suitable for neuron regeneration therapy. Patent. , (2014).
- Li, T., et al. Selection of similar single domain antibodies from two immune VHH libraries obtained from two alpacas by using different selection methods. Immunology Letters. 188, 89-95 (2017).
- Schumacher, D., Helma, J., Schneider, A. F. L., Leonhardt, H., Hackenberger, C. P. R. Nanobodies: Chemical Functionalization Strategies and Intracellular Applications. Angewandte Chemie International Edition. 57 (9), 2314-2333 (2018).
- Prehaud, C., Megret, F., Lafage, M., Lafon, M. Virus infection switches TLR-3-positive human neurons to become strong producers of beta interferon. J Journal of Virology. 79 (20), 12893-12904 (2005).
- Siflinger-Birnboim, A., et al. Molecular sieving characteristics of the cultured endothelial monolayer. Journal of Cellular Physiology. 132 (1), 111-117 (1987).
- Prehaud, C., Lafon, M., Wolff, N., Khan, Z., Terrien, E., Sanderine, V. High Mast2-affinity polypeptides and uses thereof. Patent. , (2011).
- Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 28 (2), 312-328 (2008).
- Beck, A. S., Wood, T. G., Widen, S. G., Thompson, J. K., Barrett, A. D. T. Analysis By Deep Sequencing of Discontinued Neurotropic Yellow Fever Vaccine Strains. Scientific Reports. 8 (1), 13408 (2018).
- Staples, J. E., Monath, T. P. Yellow fever: 100 years of discovery. The Journal of the American Medical Association. 300 (8), 960-962 (2008).
- Wang, E., et al. Comparison of the genomes of the wild-type French viscerotropic strain of yellow fever virus with its vaccine derivative French neurotropic vaccine. Journal of General Virology. 76 (Pt 11), 2749-2755 (1995).
- Li, T., et al. Cell-penetrating anti-GFAP VHH and corresponding fluorescent fusion protein VHH-GFP spontaneously cross the blood-brain barrier and specifically recognize astrocytes: application to brain imaging. FASEB J. 26 (10), 3969-3979 (2012).
- Garcia-Mesa, Y., et al. Immortalization of primary microglia: a new platform to study HIV regulation in the central nervous system. Journal of NeuroVirology. 23 (1), 47-66 (2017).
