Burada bir içinde cellulo BBB (kan beyin bariyerini) ayarını açıklayan bir iletişim kuralı mevcut-Minibrain polyester geçirgen membran kültür taşıma biomolecules veya enfeksiyöz ajanlar arasında bir insan BBB değerlendirmek için sistem eklemek ve onların komşu beyin hücreleri üzerinde fizyolojik etkisi.
Erken üzerinde uygun bir sinir sistemi ilaçların eleme ve hala bir karşılanmamış ihtiyaç cellulo BBB modelindeki onların penetrasyon ve bariyer ve beyin parankimi ile onların etkileşim için güvenilirdir. Bu boşluğu doldurmak için biz geçirgen membran kültür Ekle insan BBB modeli ile bir Minibrain tri-etik, kültürler tarafından insan beyin hücrelerinin (nöron, astrocytes ve mikroglial hücreleri) oluşan bir polyester birleştirerek bir 2D cellulo modelinde, BBB-Minibrain, tasarlanmıştır. BBB-Minibrain nöroprotektif uyuşturucu aday (örneğin, Neurovita) taşıma test bize aracılığıyla BBB, bu molekül nöronlar için belirli hedef belirlemek ve ilaç nöroprotektif mülkiyeti sonra korundu göstermek için izin ilaç BBB geçmişti. BBB-Minibrain virüs parçacıkları geçirilmesi endotel hücreleri bariyer arasında algılamak ve Minibrain enfeksiyon neuroinvasive virüs parçacıkları tarafından izlemek için ilginç bir model teşkil de göstermiştir. BBB-Minibrain tedavi veya hakaret sonra araştırmacı hücre Kültür Teknoloji eğitim ve beyin hücreleri fenotipleri akıllı kolay güvenilir bir sistemdir. Cellulo test ilgi tür iki kat olurdu: ilaç geliştirme erken adımda bir yandan derisking ve hayvan testleri Öte yandan kullanımının azaltılması tanıtımı.
Beyin beyin parankimi ve kan – beyin bariyerini (BBB) denilen kan arasında değişim kısıtlar geçirgen olmayan bir yapı sistemik dolaşım ayrılır. Çoğunlukla beyin endotel hücreleri oluşur, BBB dinamik olarak astrocytes, Perivasküler microglia ve komşu beyin parankimi nöronlar ile etkileşime girer. Oluşturma ve bakımını iyonik homeostazı besin ve toksik yaralanmaları koruma ile beyin temini veya giriş katkıda patojenler1,2, nöronal iþlevlerinin BBB üç önemli işlevleri vardır beyin homeostazı ve onun fonksiyonları3bakım. Sadece birkaç uyuşturucu BBB4,5geçebileceğinizi verimli bir engeldir. Şu anda, bir molekül BBB geçmek ve beyine diffüz tahmin etmek için kullanılabilir yöntemleri, ex vivo çalışmalar otopsi malzeme, görüntü izleme beyin MRI (manyetik rezonans görüntüleme) ya da evde beslenen hayvan (pozisyon emisyon tarafından insan gönüllü oluşur Tomografi) veya özellikler ve farmakokinetik preklinik çalışmalar hayvanlar6,7,8. Bu teknikleri ve modelleri evde beslenen hayvan sınırlı çözünürlük ve MRI6,8, molekülleri (yani, örneğin dayalı antikor moleküller) bu kötü ölçmek için zorluk düşük duyarlılık gibi bazı kısıtlamalar bulunmaktadır beyin7nüfuz ve preklinik için onların yüksek maliyet ve resort hayvan test çalışmaları.
Son nokta önemlidir çünkü 3R’s kuralları, (değiştirme, azaltma ve hayvan test arıtma göre) düzenleyici idarelerin araştırmacılar acilen bilimsel olarak doğru seçimli-e doğru hayvan geliştirmek istedi, deney9,10,11,12,13,14,15.
Son on yıl içinde BBB birkaç tüp bebek modelleri16,17,18 filtresinde kalkındırırken tarafından önerilmiştir membran fare, sıçan, sığır ve domuz gibi farklı türlerden endotel hücreleri ekler. İnsan türünün ilgili olarak Primer hücre kıt ve zor durumu ölümsüzleştirdi beyin endotel hücreleri veya insan kaynaklı kök hücre19,20göre insan modellerinin geliştirilmesi için araştırmacılar istenir, 21. Onlar hızlı endotel hücre işaretleri, sıkı Kavşağı işaretleri, sızma taşıyıcılar, çözünen taşıyıcı, reseptörler, bu engelleri BBB uygun tüp bebek vekilleri ile mümkündür ve endotel uyaranlara 20‘ ye yanıt. Endotel hücreleri ve diğer hücre tipleri (yani, astrocytes, nöronlar veya perisitlerden22,23,24) ile kaplı filtre membran ekler kullanarak birkaç BBB modelleri denetlesinler. Astrocytes/nöronlar veya perisitlerden tarafından çözünür faktörler salgılanmasını avantajlarından yararlanarak BBB fiziksel özelliklerini artırmak için bu ortak kültürler amacı oldu.
Yine de, bu modellerin hiçbiri çalışma ve bariyer geçtikten sonra bir uyuşturucu aday kaderi tahmin beyin parankimi içerir. Bu nedenle, amacımız içinde bir cellulo yapı oldu kan/beyin arabirimi, BBB-BBB manken ve bir kültür karışık beyin hücrelerinin tek bir kiti birleştirerek Minibrain,. BBB-Minibrain multiwell hücre kültür kalıbının kuyuya eklenen gözenekli filtre oluşan bir kültür sistemi kullanır. Filtre BBB uyuşturucu BBB oluşturmak için25,26,27, testi için son derece güvenilir kanıtlanmıştır bir insan beyni endotel hücre kültürünü hCMEC/D3 hücreleri ile kaplanır. Minibrain, insan nöronların ortak farklılaşmış bir kültür olduğu ve türetilmiş NTera/Cl2.D1 hücre satırı28,29 astrocytes CHME/Cl530 oranı karşılık gelen insan mikroglial hücre satırı ile birlikte karışık microglia nöron-astrocytes oranları beyin31, vs ekili Kalenin dibinde de.
BBB ve kaderlerini parankimi içinde uyuşturucu geçiş eğitim yanı sıra, cellulo modeli kan-beyin arabiriminde beyin (neuroinvasiveness), beyin (neurotropism) içine dağılım içine patojenlerin girişi adresine güçlü bir araç olabilir ve onlar beyin parankimi hücreleri üzerinde sarfetmek toksisite (neurovirulence). Neurovirulence ve neuroinvasiveness çalışmaları etkili bir cellulo modeli geliştirilmesi yararlanın ve hayvan modelleri yerine avantajlı. BBB-Minibrain kiti32kullanarak, biz neuroinvasive fenotip hazırlamak için kullanılan Fransızca Neurotropic virüs suşu sarı humma virüsü (yani, FNV’nin-YFV33,34) içinde birikmiş nadir viral mutantların gösterdi bir iptal edilen canlı YFV aşı ve Neurovita (bundan böyle NV el yazması da adlandırılır)35denilen bir neuroregenerative ve nöroprotektif biomolecule geçirilmesi. Çünkü NV ikisi de doğal olarak hücre zarı haçlar ne de değişken bölümü (VHH) ile BBB dahil olmak üzere biyolojik membran aşar ve işlevleri molekül (BGBM)36delici bir hücre Lama bir tek zincir antikor, BBB, NV erimiş. VHH BGBM mülkiyeti isoelectric noktası ve VHH37uzunluğu bağlı gibi görünüyor.
Böyle cellulo testinde daha potansiyel olarak BBB farmakokinetik taşıyan ve özellikler analysis hayvanlarda ve ideal olarak gergin onların davranış tahmin edebilmek için aynı zamanda önce geçebileceği molekülleri sıralamak mümkün olacak parankimi. Bu sistem biyolojik olarak ilgili ve kolay kurulum ve hücre kültürü26,29,30,38içinde iyi eğitimli profesyoneller tarafından idare edilmiştir. Cellulo test ilgi tür iki kat olur: bir yandan preklinik testleri maliyetlerinin azaltılması ve diğer yandan hayvan test kullanımının azaltılması.
Bu makalede biz içinde bir cellulo inşa etmek nasıl gösterdi kan/beyin arabirimi, BBB-BBB manken ve kültürünün birleştirerek Minibrain, karışık beyin beyin hücreleri (Minibrain) tek bir kit. Bu sistem biyolojik ilgili, basit-e doğru kurmak ve iyi eğitimli hücre kültüründe Denemecileri için kolu.
Şiddetli gerginlik bariyer kontrolünü uygulanırsa herhangi bir diğer tüp bebek model BBB gelince, güvenilir sonuçlar elde. Geçirgenliği ve herhangi bir INSERT yetersiz ge?…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada Institut Pasteur bir Incitative Ödülü (PTR 435) dahil olmak üzere gelen iç hibe ve “Kervansaray’a de Soutien à la Recherche” sağlanan bir hibe tarafından Sanofi Pasteur Institut Pasteur için desteklenen bir durumdu. A. da Costa Sanofi Pasteur grant ve Florian Bakoa tarafından desteklenen olduğunu ANRT tarafından sağlanan bir doktora hibe alıcı (Derneği Nationale de la Recherche et de la Technologie). Biz yararlı tartışmalar için Pr Pierre-Olivier Couraud ve Dr Floransa Miller için borçlu bulunmaktadır.
12 well plates | Corning | 3336 | |
5-fluoro-2’deoxyuridine | Merck-Sigma Aldrich | F0503 | |
85mm Petri Dish | Sarstedt | 83-3902-500 | |
Anti-Nf200 | Merck-Sigma Aldrich | N4142 | |
β-mercapto-ethanol | Merck-Sigma Aldrich | M3148 | |
CHME/Cl5 | Unité de Neuroimmunologie Virale | On request to Dr Lafon | |
CMC | Calbiochem | 217274 | |
Cytosine β-D-arabinofuranoside | Merck-Sigma Aldrich | C1768 | |
Dark 96 well plates | Corning | 3915 | |
DMEM F12 | Thermofisher Scientific | 31330-038 | |
DMSO | Merck-Sigma Aldrich | D2650 | |
Endogro IV | Millipore | SCME004 | endothelial cell medium |
Ethanol | Carlo Erba | 529121 | |
FBS | Hyclone | SV30015-04 | |
Formaldehyde | Merck-Sigma Aldrich | 252549 | |
GIEMSA | RAL Diagnostic | 320310 | |
Goat-Anti Mouse | Jackson Immuno Research | 115-545-003 | |
Goat-Anti Rabbit | Thermofisher Scientific | R37117 | |
HBSS with Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14025-100 | |
hCMEC/D3 | Cedarlane | CLU512 | |
Hepes 1M | Thermofisher Scientific | 15630-070 | |
Hoescht 33342 | Merck-Sigma Aldrich | 33263 | |
Laminine | Merck-Sigma Aldrich | L6274 | |
L-glutamin | Thermofisher Scientific | 25030-024 | |
Lucifer Yellow | Merck-Sigma Aldrich | L0259 | |
MEM 10X | Thermofisher Scientific | 21430 | |
MEM 1X | Thermofisher Scientific | 42360 | |
Ntera/Cl2D.1 | ATCC | CRL-1973 | |
Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15714 | |
PBS without Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14190 | |
PBS-Ca2+-Mg2+ | Thermofisher Scientific | 14040-091 | |
Pen/Strep | Eurobio | CXXPES00-07 | |
Poly-d-Lysine | Merck-Sigma Aldrich | P1149 | |
Prolong Gold | Thermofisher Scientific | P36930 | |
Qiashredder | QIAGEN | 79656 | |
Rat Collagen I | Cultrex | 3443-100-01 | |
Retinoic Acid All-Trans | Merck-Sigma Aldrich | R2625 | |
RNA purification kit | QIAGEN | 74104 | |
SDS | Merck-Sigma Aldrich | L4509 | |
Sodium bicarbonate 5.6% | Eurobio | CXXBIC00-07 | |
Sodium Pyruvate | Thermofisher Scientific | 11360 | |
T75 Cell+ Flask | Sarstedt | 83-1813-302 | Tissue culture polystyrene flask with specific surface treatment (Cell+) for sensitive adherent cells |
Transwell | Corning | 3460 | polyester porous membrane culture inserts |
Trypsin-EDTA | Merck-Sigma Aldrich | T3924 | |
Ultra Pure Water | Thermofisher Scientific | 10977-035 | |
Uridine | Merck-Sigma Aldrich | U3750 | |
Versene | Thermofisher Scientific | 15040-033 | EDTA |
YFV-FNV | IP Dakar | Vaccine vial |