Patiënt-afgeleide Orthotopic xenograft modellen voor humaan Urotheelcelcarcinoom en colorectale kanker tumor groei en spontane metastasen
Summary
Dit protocol beschrijft de generatie van door patiënten afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is-modellen door intra-vesisch bijbrengen van hoogwaardige urotheelcelcarcinoom cellen of intra-rectale injectie van colorectale kankercellen in niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van lymfeklier stromale cellen, die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten nabootst.
Abstract
Kankerpatiënten hebben slechte prognoses wanneer de lymfeklier (LN) betrokken is bij zowel hoogwaardig urotheliaal celcarcinoom (HG-UCC) van de blaas en colorectale kanker (CRC). Meer dan 50% van de patiënten met spier-invasieve UCC, ondanks curatieve therapie voor klinisch gelokaliseerde ziekte, zal metastasen ontwikkelen en sterven binnen 5 jaar, en gemetastaseerde CRC is een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in de VS. Xenograft-modellen die consequent de UCC en CRC-metastasen nabootsen die bij patiënten worden gezien, zijn nodig. Deze studie is gericht op het genereren van patiënt-afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is (pdox) modellen van UCC en CRC voor primaire tumorgroei en spontane metastasen onder invloed van LN stromale cellen die de progressie van humane gemetastaseerde ziekten voor geneesmiddelen screening nabootsen. Verse UCC-en CRC-tumoren werden verkregen uit patiënten met toestemming die resectie voor respectievelijk HG-UCC en colorectale adenocarcinoom ondergingen. Samen met LN stromale Cell (LNSC) analoge HK-cellen waren Luciferase-gelabelde UCC-cellen intra-vesisch (IB) ingeprent in vrouwelijke niet-zwaarlijvige diabetische/ernstige gecombineerde immunodeficiëntie (NOD/SCID) muizen, en CRC-cellen waren intra-rectaal (IR) geïnjecteerd in mannelijke NOD/SCID muizen. Tumor groei en metastase werden wekelijks gemonitord met behulp van bioluminescentie Imaging (BLI). Bij het offeren werden primaire tumoren en muis organen geoogst, gewogen en formaline-vast voor hematoxyline en eosine en immunohistochemie kleuring. In onze unieke pdox-modellen lijken xenotransplantaatmodellen is-tumoren op patiënten pre-implantatie tumoren. In aanwezigheid van HK cellen, beide modellen hebben hoge tumor implantatie tarieven gemeten door BLI en tumor gewichten, 83,3% voor UCC en 96,9% voor CRC, en hoge verre orgaan metastasen tarieven (33,3% gedetecteerd lever of longmetastasen voor UCC en 53,1% voor CRC). Bovendien hebben beide modellen nul sterfte van de procedure. We hebben unieke, reproduceerbare PDOX modellen vastgesteld voor menselijke HG-UCC en CRC, die het mogelijk maken voor tumorvorming, groei en metastase studies. Met deze modellen kan het testen van nieuwe therapeutische geneesmiddelen efficiënt en klinisch-mimetische wijze worden uitgevoerd.
Introduction
Het is aangetoond dat lymfeklier (ln) metastase een slechte prognostische indicator is in veel vaste orgaanmaligniteiten, waaronder hoogwaardig urotheliaal celcarcinoom (UCC) van de blaas en colorectale kanker (CRC)1,2. Meer dan de helft van de patiënten met spier-invasieve UCC (MIUCC), ondanks curatieve therapie voor klinisch gelokaliseerde ziekte, zal metastasen ontwikkelen en sterven binnen 5 jaar. Metastatische CRC is een belangrijke oorzaak van kanker-gerelateerde dood in de VS.
Naar schatting 81.190 nieuwe patiënten en 17.240 kanker specifieke sterfgevallen optreden in 2018 in de Verenigde Staten als gevolg van UCC van de blaas3,4. Terwijl patiënten voornamelijk (70%) aanwezig met niet-spier invasieve ziekte, 30% zal MIUCC5hebben. Ondanks de curatieve therapie (radicale cystectomie [RC] met of zonder systemische chemotherapie) voor klinisch gelokaliseerde ziekte, zal de helft van de patiënten met MIUCC van de blaas nog steeds metastasen ontwikkelen en sterven binnen 5 jaar3. De betrokkenheid van lymfeklieren komt voor bij ongeveer 20% − 25% van de patiënten die RC6,7,8hebben ondergaan. De overlevings ratio van vijf jaar in LN positieve patiënten is minder dan 35%, zelfs na RC, wat de betrokkenheid van LN suggereert als een cruciale negatieve voorspeller voor de prognose bij UCC-patiënten.
Colorectale kanker is de derde meest voorkomende kanker gediagnosticeerd in zowel mannen als vrouwen in de Verenigde Staten. De resultaten van de patiënt zijn grotendeels afhankelijk van de tumor kenmerken en tumor micro-omgeving, zoals de diepte van de invasie, de betrokkenheid van LN en verre orgaan metastasen. Hoewel het sterftecijfer in CRC in het laatste decennium daalde als gevolg van screening en effectieve operaties, wordt geschat dat bijna 50% van de CRC-patiënten metastasen of recidiverende ziekte zal ontwikkelen9.
Kleine diermodellen bieden een snel, reproduceerbaar en modificeerbaar platform om tumorprogressie en verschillende gemetastaseerde patronen te bestuderen. Er zijn momenteel geen beschreven xenotransplantaatmodellen is modellen die consequent CRC en UCC metastasen na gezien bij patiënten. De primaire route van kanker verre metastasen is via lymfatische spreiding. Nieuw onderzoek suggereert dat de LNS bieden tumoren met een unieke micro-omgeving, en zijn niet alleen gewoon stationaire doelen waar kankercellen tijdelijk passeren, maar ook een integrale rol spelen door interactie met kankercellen in het gemetastaseerde proces. Inderdaad, onze studies ontdekten dat, naast het opleiden en bevorderen van tumorprogressie en metastasen, de LN stromale micro Environment ook verantwoordelijk is voor de resistentie van geneesmiddelen in CRC10,11. Ons lab bevestigde onlangs de tumorigene-effecten van LN stromale Cells (lnscs) op CRC en uccs met behulp van patiënt-afgeleide orthotopic xenotransplantaatmodellen is (pdox) Muismodellen12,13.
Het ontwikkelen van pdox modellen biedt een belangrijk platform voor translationeel kankeronderzoek14,15. Door de belangrijkste histologische en genetische kenmerken van hun donor tumor te handhaven, blijven de pdox-modellen stabiel over de passages en maken ze goede platformen voor translationeel kankeronderzoek12,15. PDOX-modellen worden gebruikt voor de evaluatie van preklinische geneesmiddelen, biomarker-identificatie en preklinische evaluatie van gepersonaliseerde geneeskunde strategieën die voorspelling van klinische uitkomsten mogelijk maken. Momenteel zijn er geen beschreven xenotransplantaatmodellen is-modellen die het belang van de betrokkenheid van LN overwegen en in staat zijn om consistent primaire tumor en verre orgaan metastasen te reproduceren in CRC en UCC. In deze studie beschrijven we de ontwikkeling van PDOX-modellen in knik/SCID-muizen met reproductie van gemetastaseerde CRC-en UCC-ziekten met betrokkenheid van LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gemetastaseerde ziekte is verantwoordelijk voor de meeste sterfte bij kankerpatiënten. In preklinische therapeutische tests is het van cruciaal belang om Muismodellen te maken die de menselijke tumorgroei het nauwst emuleren met spontane verre orgaan metastasen. Met behulp van Murine modellen met geïmplanteerde patiënt tumor afgeleide kankercellen (xenografts) zorgt voor een beter begrip van de tumor biologie en voorspellende biomarkers, alsmede het testen en voorspellen van Antineoplastische effecten van nieuwe thera…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, en Shannon McChesney die hebben bijgedragen aan het initiëren van deze studies voor hun uitstekende technische ondersteuning. De auteurs bedanken ook Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar en Maria Latsis voor hulp bij patiënten met toestemming en het verstrekken van tumor specimens.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
