Insan Üromotorial Hücre Karsinomu ve kolorektal kanser tümörü büyüme ve spontan Metasrik için hasta türevi Ortootopik xenograft modelleri
Summary
Bu protokol, yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu hücrelerinin intra-vesically instilling veya intra-rektal enjekte kolorektal kanser hücreleri olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine tarafından hasta türeyen ortootopik xenograft modellerinin oluşturulması açıklanmaktadır immüneksikliği (NOD/SCıD) primer tümör büyümesi için fareler ve lenf nodu stromal hücrelerin etkisi altında spontan metastaz, hangi insan metastatik hastalıkların ilerlemesini taklit.
Abstract
Kanser hastaları, mesane ve kolorektal kanseri (CRC) hem yüksek dereceli ürosityal Hücre Karsinomu (HG-UCC) içinde lenf nodu (LN) tutulumu olduğunda kötü prognostiklere sahiptir. Kas-invaziv UCC olan hastaların% 50 ‘ den fazla, klinik lokalize hastalık için küratif tedaviye rağmen, metastaz geliştirmek ve 5 yıl içinde ölmek, ve metastatik CRC ABD ‘de kansere bağlı ölümlerin önde gelen nedenidir. Hastalarında sürekli olarak UCC ve CRC metasrik taklit eden xenograft modelleri gereklidir. Bu çalışmada primer tümör büyümesi için UCC ve CRC ‘nin hasta türevi ortootopik xenograft (PDOX) modelleri ve LN stromal hücrelerinin etkisi altında spontan metastaz modeli, insan metastatik hastalıklarının ilaç taraması için ilerlemesini taklit etmeyi amaçlamaktadır. HG-UCC ve kolorektal adenokarsinoma için rezeksiyon yapılarak, sırasıyla taze UCC ve CRC tümörleri elde edildi. LN stromal Cell (LNSC) Analog HK hücreleri ile ortak inoküle, luciferase-etiketli UCC hücreleri intra-vesically vardı (ıB) kadın olmayan obez diyabetik/şiddetli kombine immünyetmezlik (NOD/SCıD) fareler, ve CRC hücreleri intra-rektik edildi (IR) içine enjekte Erkek NOD/SCıD fareler. Tümör büyümesi ve metassel, Bioluminesans görüntüleme (BLı) kullanılarak haftalık olarak izleniyor. Kurban üzerine, primer tümörler ve fare organları hasat edildi, tartıldı, ve formalin-hematoxylin ve eozin ve immünhistokimya boyama için sabit. Benzersiz PDOX modellerinde, xenograft tümörleri hasta ön implantasyon tümörlerine benzerdir. HK hücrelerinin varlığında, her iki model de BLı ve tümör ağırlıkları ile ölçülen yüksek tümör implantasyon oranları, 83,3% UCC ve% 96,9 CRC için, ve yüksek uzak organ metastaz oranları (% 33,3 tespit karaciğer veya akciğer metastaz için UCC ve% 53,1 CRC için). Buna ek olarak, her iki model yordamdan sıfır mortalite vardır. İnsan HG-UCC ve CRC için benzersiz, tekrarlanabilir PDOX modelleri kurduk, bu da tümör oluşumuna, büyümesini ve metasük çalışmalarına izin verir. Bu modellerde, yeni terapötik ilaçların test edilmesi verimli ve klinik olarak mimetic bir şekilde yapılabilir.
Introduction
Lenf nodu (LN) metastazının, mesane ve kolorektal kanser (CRC)1,2‘ nin yüksek dereceli ürogariyal Hücre Karsinomu (UCC) dahil olmak üzere birçok katı organ malignitesinde kötü prognostik bir gösterge olduğunu göstermiştir. Kas-invaziv UCC (MıUCC) olan hastaların yarısından fazlası, klinikte lokalize hastalık için küratif tedaviye rağmen, 5 yıl içinde metastanca gelişecek ve ölür. Metastatik CRC ABD ‘de kanser ile ilgili ölüm önde gelen nedenidir.
Tahmini 81.190 yeni hastalar ve 17.240 kanser spesifik ölümlerin, ABD ‘de, mesane3,4UCC nedeniyle 2018 yılında gerçekleşmesi bekleniyor. Hastalar ağırlıklı olarak (% 70) Kas invazif olmayan hastalık ile mevcut,% 30 MıUCC5olacaktır. Klinikte lokalize hastalık için küratif tedaviye (radikal cystektomi [RC] veya sistemik kemoterapi olmadan) rağmen, mesane MIUCC olan hastaların yarısı hala metasürler geliştirecek ve 5 yıl içinde ölmek3. RC6,7,8‘ deki hastaların yaklaşık% 20 −% 25 ‘ inde lenf nodu tutulumu bulunmuştur. LN pozitif hastalarda beş yıllık hayatta kalma oranı, RC ‘den sonra bile% 35 ‘ den az, UCC hastalarında prognoz için önemli bir negatif öngörü olarak LN tutulumu öneriyor.
Kolorektal kanser, Amerika Birleşik Devletleri ‘nde hem erkek hem de kadınlarda teşhis edilen üçüncü en yaygın kanserdir. Hastanın sonuçları büyük ölçüde invazyonu, LN tutulumu ve uzak organ metastaz derinliği gibi tümör özelliklerine ve tümör mikroortamına bağlıdır. Tarama ve etkili ameliyatlar nedeniyle son on yılda CRC ‘deki mortalite oranı azalsa da, CRC hastalarının yaklaşık% 50 ‘ si metasrat veya tekrarlayan hastalık9‘ da gelişecektir.
Küçük hayvan modelleri, tümör progresyonu ve farklı metastatik desenleri incelemek için hızlandırılabilen, tekrarlanabilir ve değiştirilebilir bir platform sağlar. Şu anda, hastalarda görülen CRC ve UCC metasrik olarak taklit edilen xenograft modelleri tanımlanmıştır. Kanser uzak metastaz primer rota lenfatik Spread yoluyla. Yeni araştırma LNs benzersiz bir mikroçevre ile tümörlerin sağlamak ve sadece sadece sabit hedefler nerede kanser hücrelerinin geçmeli geçiş olduğunu göstermektedir, aynı zamanda metastatik süreçte kanser hücreleri ile etkileşim tarafından ayrılmaz bir rol oynar. Gerçekten de, çalışmalarımız, tümör progresyonu ve metastacıları eğitmek ve teşvik etmek yanı sıra, ın stromal mikroçevre da CRC10,11ilaç direnci sorumlu olduğunu keşfetti. Laboratuvarımız son zamanlarda, in stromal hücrelerinin (lnscs) CRC ve uccs üzerinde hasta tarafından türetilen ortootopik xenograft (PDOX) fare modellerini kullanarak tümör etkilerini doğruladı12,13.
PDOX modellerini geliştirmek translasyonel kanser araştırması için önemli bir platform sağlar14,15. PDOX modelleri, donör tümörlerinin temel histolojik ve genetik özelliklerini koruyarak, pasajlar arasında kararlı kalır ve translasyonel kanser araştırması için iyi platformlar yapar12,15. PDOX modelleri preklinik ilaç değerlendirmesi, biyomarker tanımlaması ve klinik sonuçların öngörülerine izin veren kişiselleştirilmiş tıp stratejilerinin preklinik değerlendirilmesi için kullanılmaktadır. Şu anda, LN tutulumunun önemini dikkate alan ve CRC ve UCC ‘de primer tümör ve uzak organ metastaz sürekli olarak yeniden üretebilmiyor, açıklanan xenograft modelleri yoktur. Bu çalışmada, ıNSC tutulumu ile metastatik CRC ve UCC hastalıklarının çoğaltılması ile NOD/SCıD farelerinde PDOX modellerinin gelişimini tarif ediyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Metastatik hastalık çoğu kanser hastası mortaliteleri için sorumludur. Klinik öncesi terapötik testlerde, insan tümörü büyümesini spontan uzak organ metastazı ile en yakından taklit eden fare modelleri kurmak çok önemlidir. İmplante edilen hasta tümörü ile duvar modellerini kullanarak kanser hücreleri türetilmiştir (xenografts) tümör biyoloji ve öngörü biyolojik daha iyi bir anlayış yanı sıra test ve yeni tedaviler Antineoplastik etkileri tahmin sağlar18. Bir çok …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller, ve Shannon McChesney onların mükemmel teknik destek için bu çalışmaları başlatmak için yardımcı teşekkür ederiz. Yazarlar da Heather yeşil Matrana, Margaret Variano, Sunil taşa, ve Maria Latsis yardım için hasta ve tümör numuneleri sağlamak için teşekkür ederiz.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
- Sundlisaeter, E., et al. Lymphangiogenesis in colorectal cancer–prognostic and therapeutic aspects. International Journal of Cancer. Journal international du cancer. 121, 1401-1409 (2007).
- Gout, S., Huot, J. Role of cancer microenvironment in metastasis: focus on colon cancer. Cancer Microenvironment. 1, 69-83 (2008).
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2018. CA: a Cancer Journal for Clinicians. 68, 7-30 (2018).
- Hautmann, R. E., de Petriconi, R. C., Pfeiffer, C., Volkmer, B. G. Radical cystectomy for urothelial carcinoma of the bladder without neoadjuvant or adjuvant therapy: long-term results in 1100 patients. European Urology. 61, 1039-1047 (2012).
- Stein, J. P., et al. Radical cystectomy in the treatment of invasive bladder cancer: long-term results in 1,054 patients. Journal of Clinical Oncology. 19, 666-675 (2001).
- Lerner, S. P., et al. The rationale for en bloc pelvic lymph node dissection for bladder cancer patients with nodal metastases: long-term results. The Journal of Urology. 149, 758-764 (1993).
- Poulsen, A. L., Horn, T., Steven, K. Radical cystectomy: extending the limits of pelvic lymph node dissection improves survival for patients with bladder cancer confined to the bladder wall. The Journal of Urology. 160, 2015-2019 (2020).
- Margolin, D. A., et al. Lymph node stromal cells enhance drug-resistant colon cancer cell tumor formation through SDF-1alpha/CXCR4 paracrine signaling. Neoplasia. 13, 874-886 (2011).
- Vermeulen, L., et al. Wnt activity defines colon cancer stem cells and is regulated by the microenvironment. Nature Cell Biology. 12, 468-476 (2010).
- Margolin, D. A., et al. The critical roles of tumor-initiating cells and the lymph node stromal microenvironment in human colorectal cancer extranodal metastasis using a unique humanized orthotopic mouse model. FASEB Journal. 29, 3571-3581 (2015).
- Gills, J., et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729 (2018).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discovery. 4, 998-1013 (2014).
- Hiroshima, Y., et al. Patient-derived mouse models of cancer need to be orthotopic in order to evaluate targeted anti-metastatic therapy. Oncotarget. 7, 71696-71702 (2016).
- Kim, H. S., Zhang, X., Klyushnenkova, E., Choi, Y. S. Stimulation of germinal center B lymphocyte proliferation by an FDC-like cell line, HK. The Journal of Immunology. 155, 1101-1109 (1995).
- Hite, N., et al. An Optimal Orthotopic Mouse Model for Human Colorectal Cancer Primary Tumor Growth and Spontaneous Metastasis. Diseases of the Colon and Rectum. 61, 698-705 (2018).
- Jager, W., et al. Ultrasound-guided intramural inoculation of orthotopic bladder cancer xenografts: a novel high-precision approach. PloS One. 8, e59536 (2013).
- Schirner, M., et al. Integrin alpha5beta1: a potent inhibitor of experimental lung metastasis. Clinical & Experimental Metastasis. 16, 427-435 (1998).
- Ricci-Vitiani, L., et al. Identification and expansion of human colon-cancer-initiating cells. Nature. 445, 111-115 (2007).
- Todaro, M., et al. Colon cancer stem cells dictate tumor growth and resist cell death by production of interleukin-4. Cell Stem Cell. 1, 389-402 (2007).
- Lee, J. S., et al. Tumor establishment features of orthotopic murine bladder cancer models. Korean Journal of Urology. 53, 396-400 (2012).
- Hadaschik, B. A., et al. A validated mouse model for orthotopic bladder cancer using transurethral tumour inoculation and bioluminescence imaging. BJU International. 100, 1377-1384 (2007).
- Silinsky, J., et al. CD 133+ and CXCR4+ colon cancer cells as a marker for lymph node metastasis. The Journal of Surgical Research. 185, 113-118 (2013).
