Modèles de xénogreffe orthopiques dérivés du patient pour le carcinome humain de cellules urotheliales et la croissance de tumeur de cancer colorectal et la métastasie spontanée
Summary
Ce protocole décrit la génération des modèles de xénogreffe orthotopic-dérivés du patient en inculquant intra-vesically les cellules de carcinome urothelial de haut grade ou les cellules de cancer colorectal intra-rectally injectant dans le diabétique non-obèse/grave combiné Souris d’immunodéficience (NOD/SCID) pour la croissance primaire de tumeur et les métastases spontanées sous l’influence des cellules stromal de ganglion lymphatique, qui imite la progression des maladies métastatiques humaines.
Abstract
Les patients cancéreux ont de mauvais pronostics lorsque la participation des ganglions lymphatiques (LN) est présente dans le carcinome urothélial à haut grade (HG-UCC) de la vessie et le cancer colorectal (CRC). Plus de 50% des patients atteints d’UCC herminant, en dépit de la thérapie curative pour la maladie cliniquement localisée, développeront des métastases et mourront dans les 5 ans, et le CRC métastatique est une cause principale de décès liés au cancer aux États-Unis. Les modèles de Xénogreffe qui imitent uniformément la métasse d’UCC et de CRC vu dans les patients sont nécessaires. Cette étude vise à générer des modèles de xénogreffe orthotopique d’origine du patient (PDOX) de l’UCC et du CRC pour la croissance tumorale primaire et les métastases spontanées sous l’influence des cellules stromales de LN imitant la progression des maladies métastatiques humaines pour le dépistage des médicaments. Des tumeurs fraîches d’UCC et de CRC ont été obtenues des patients consentés subissant la résection pour HG-UCC et adénocarcinome côlorectal, respectivement. Co-inoculés avec des cellules HK analogiques de cellules stromales de LN (LNSC), les cellules d’UCC luciferase-étiquetées ont été intra-vesically (IB) inculquées dans les souris femelles diabétiques/graves combinées d’immunodéficience (NOD/SCID), et les cellules de CRC ont été intra-rectally (IR) injectées dans souris mâles NOD/SCID. La croissance et la métatasie de tumeur ont été surveillées hebdomadairement utilisant la formation image de bioluminescence (BLI). Au sacrifice, les tumeurs primaires et les organes de souris ont été moissonnés, pesés, et formalin-fixés pour l’hématoxylin et l’éosine et la coloration d’immunohistochemistry. Dans nos modèles uniques de PDOX, les tumeurs de xénogreffe ressemblent aux tumeurs de préimplantation patiente. En présence des cellules de HK, les deux modèles ont des taux élevés d’implantation de tumeur mesurés par BLI et poids de tumeur, 83.3% pour UCC et 96.9% pour CRC, et les taux éloignés élevés de métastes d’organe (33.3% ont détecté la métaste de foie ou de poumon pour UCC et 53.1% pour CRC). En outre, les deux modèles ont zéro mortalité de la procédure. Nous avons établi des modèles PDOX uniques et reproductibles pour les hG-UCC et crC humains, qui permettent la formation, la croissance, et les études de métatasie de tumeur. Avec ces modèles, l’essai de nouveaux médicaments thérapeutiques peut être exécuté efficacement et d’une manière cliniquement-mimétique.
Introduction
Il a été démontré que la métasse des ganglions lymphatiques (LN) est un mauvais indicateur pronostique dans de nombreuses malignités d’organes solides, y compris le carcinome urothélial à haut grade (UCC) de la vessie et du cancer colorectal (CRC)1,2. Plus de la moitié des patients atteints d’UCC (MIUCC) invasif musculaire, malgré la thérapie curative pour la maladie cliniquement localisée, développeront des métastases et mourront dans les 5 ans. Le CRC métastatique est l’une des principales causes de décès liés au cancer aux États-Unis.
On estime que 81 190 nouveaux patients et 17 240 décès par cancer devraient survenir en 2018 aux États-Unis en raison de l’UCC de la vessie3,4. Alors que les patients seront principalement (70%) avec la maladie invasive non-musculaire, 30% auront MIUCC5. En dépit de la thérapie curative (cystectomie radicale [RC] avec ou sans chimiothérapie systémique) pour la maladie médicalement localisée, la moitié des patients présentant MIUCC de la vessie développeront toujours des métastases et mourront dans les 5 ans3. La participation de ganglion lymphatique est trouvée dans approximativement 20%-25% de patients ayant subi RC6,7,8. Le taux de survie à cinq ans dans les patients positifs de LN est moins de 35% même après RC, suggérant la participation de LN comme prédicteur négatif crucial pour le pronostic dans les patients d’UCC.
Le cancer colorectal est le troisième cancer le plus fréquent diagnostiqué chez les hommes et les femmes aux États-Unis. Les résultats de patient dépendent en grande partie des caractéristiques de tumeur et du microenvironnement de tumeur, tels que la profondeur de l’invasion, la participation de LN, et les métastases éloignées d’organe. Bien que le taux de mortalité au CRC ait diminué au cours de la dernière décennie en raison du dépistage et des chirurgies efficaces, on estime que près de 50 % des patients atteints du CRC développeront des métastases ou des maladies récurrentes9.
Les modèles de petits animaux fournissent une plate-forme expéditive, reproductible, et modifiable pour étudier la progression de tumeur et les modèles métastatiques différents. Il n’y a actuellement aucun modèle décrit de xénogreffe qui imitent uniformément la métaste de CRC et d’UCC vue dans les patients. La voie principale de la métastes lointaines de cancer est par la propagation lymphatique. De nouvelles recherches suggèrent que les LN fournissent aux tumeurs un microenvironnement unique, et ne sont pas seulement des cibles fixes où les cellules cancéreuses passent transitoirement, mais jouent également un rôle intégral en interagissant avec les cellules cancéreuses dans le processus métastatique. En effet, nos études ont découvert que, en plus d’éduquer et de promouvoir la progression tumorale et les métastases, le microenvironnement stromal LN est également responsable de la résistance aux médicaments dans CRC10,11. Notre laboratoire a récemment confirmé les effets tumorigènes des cellules stromales LN (LNSC) sur le CRC et les UCC à l’aide de modèles de souris orthopiques dérivés du patient12,13.
Le développement de modèles PDOX constitue une plate-forme importante pour la recherche translationnelle sur le cancer14,15. En maintenant les principales caractéristiques histologiques et génétiques de leur tumeur donneuse, les modèles PDOX restent stables sur tous les passages et constituent de bonnes plateformes pour la recherche translationnelle sur le cancer12,15. Les modèles PDOX sont utilisés pour l’évaluation préclinique des médicaments, l’identification des biomarqueurs et l’évaluation préclinique de stratégies de médecine personnalisée permettant de prédire les résultats cliniques. Actuellement, il n’y a aucun modèle décrit de xénogreffe qui considèrent l’importance de la participation de LN et sont capables de reproduire uniformément la tumeur primaire et la métaste éloignée d’organe dans CRC et UCC. Dans cette étude, nous décrivons le développement des modèles de PDOX chez les souris NOD/SCID avec la reproduction des maladies métastatiques de CRC et d’UCC avec la participation de LNSC.
Protocol
Representative Results
Discussion
La maladie métastatique est responsable de la plupart des décès des patients atteints de cancer. Dans les essais thérapeutiques précliniques, il est crucial d’établir des modèles de souris qui imitent le plus étroitement la croissance humaine de tumeur avec les métastases lointaines spontanées d’organe. L’utilisation de modèles murins avec des cellules cancéreuses dérivées de tumeurs du patient implanté (xénogreffes) permet une meilleure compréhension de la biologie tumorale et des biomarqueurs prédicti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs remercient Brian Reuter, Danielle Bertoni, Peter Miller et Shannon McChesney qui ont aidé à lancer ces études pour leur excellent soutien technique. Les auteurs remercient également Heather Green Matrana, Margaret Variano, Sunil Talwar et Maria Latsis pour leur aide dans le consentement des patients et la fourniture de spécimens tumoraux.
Materials
| Avidin-biotin-peroxidase | Vector Labs Inc | PK-6100 | |
| Biotinylated secondary antibody | Vector Labs Inc | BA-1000 | |
| Collagenase IV (1.5 mg/mL) | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| Deoxyribonuclease I (0.1 mg/mL) | Sigma | D4263 | |
| D-Luciferin (150 mg/kg) | Perkin Elmer | 122796 | |
| Formalin (10% neutral buffered) | Leica | 46129 | |
| glutamine (2 nM) | Fisher Scientific | 35050061 | |
| Hair Removal Cream | Church & Dwight Co., Inc | 1 (800) 248-8820 | |
| Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | Fisher Scientific | SH30016.02 | |
| Hyaluronidase (20 mg/mL) | Sigma | H3884 | |
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 108333 | |
| Luc/RFP-lentivirus | From our collaborators. See reference 13: Gills, J. et al. A patient-derived orthotopic xenograft model enabling human high-grade urothelial cell carcinoma of the bladder tumor implantation, growth, angiogenesis, and metastasis. Oncotarget. 9, 32718-32729, doi:10.18632/oncotarget.26024 (2018). | ||
| McCoy’s medium | Life Technologies | 110862 | |
| penicillin/streptomycin 100 mL (100 U/mL) | Fisher Scientific | 15140-122 | |
| RPMI-1640 Medium | American Type Culture Collection | 110636 | |
| Trypan Blue | Sigma | T6146 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 15400-054 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gas | |||
| 100% Oxygen | Airgas Inc | OX USP200 | |
| 100% CO2 | Airgas Inc | CD USPE | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | |||
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (male) | Jackson Lab | 001303 | |
| 6-8 week old NOD/SCID Mice (female) | Jackson Lab | 001303 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Immunohistochemistry | |||
| Hematoxylin | Sigma | GHS232 | |
| Ki-67 Rabbit Monoclonal Antibody | Thermo Scientific | RM-9106-S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tools | |||
| 40 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-1 | |
| 100 µm cell strainer | Fisher Scientific | 08-771-19 | |
| 15 mL Conical Tube | Sarstedt | 11799 | |
| 50 mL Conical tube | Sarstedt | 15762 | |
| 150 mm Tissue Culture Dish | USA Scientific Inc | CC7682-3614 | |
| 96 Well plate | USA Scientific Inc | CC7682-7596 | |
| Forceps | Symmetry Surgical Inc | 06-0011 | |
| Surgical scissors | Symmetry Surgical Inc | 02-2011 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 5% CO2 humidified incubator | Thermo Scientific | 3110 | |
| Bioluminescent (BLI) Imaging Machine | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| BLI Imaging Machine Software | Perkin Elmer | CLS136334 | |
| Centrifuge | Beckman | 366830 | |
| Deconvoluting Microscope | Intelligent Imaging Innovations | Marianas | |
| Deconvoluting Microscope Imaging Software | Intelligent Imaging Innovations | +1 (303) 607-9429 x1 | |
| Digital caliper | Fowler Tools and Instruments | 54-115-330 | |
| Dissecting microscope | Precision Instruments LLC | (504) 228-0076 | |
| Electrosurgical generator | ValleyLab | FORCE1C20 | |
| Isoflurane Induction Chamber | Perkin Elmer | 119038 | |
| Microtome | American Optical Corporation | 829 | |
| Pipet Aid | Fisher Healthcare | 13-681-15E | |
| Serological pipet (10 mL) | Sarstedt | 86.1254.001 |
References
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