Belangrijke eindpunten en proliferatieve markers om kleine darm letsel en aanpassing te beoordelen met behulp van een muis model van chemotherapie-geïnduceerde Mucositis
Summary
Hier presenteren we een protocol voor het vaststellen van belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine intestinale letsel en compenserende hyperproliferatie met behulp van een model van chemotherapie-geïnduceerde mucositis. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker en met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten.
Abstract
Intestinale adaptatie is het natuurlijke compenserende mechanisme dat optreedt wanneer de darm verloren gaat als gevolg van trauma. De adaptieve reacties, zoals crypte celproliferatie en verhoogde nutriënten absorptie, zijn van cruciaal belang in herstel, maar slecht begrepen. Inzicht in het moleculaire mechanisme achter de adaptieve responsen is cruciaal om de identificatie van nutriënten of geneesmiddelen te vergemakkelijken om de aanpassing te verbeteren. Verschillende benaderingen en modellen zijn beschreven in de hele literatuur, maar een gedetailleerde beschrijvende manier om de procedures in wezen uit te voeren is nodig om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Hier beschrijven we een methode om belangrijke eindpunten en proliferatieve markers van kleine darm letsel en compenserende hyperproliferatie te schatten met behulp van een model van door chemotherapie geïnduceerde mucositis bij muizen. We demonstreren de detectie van prolifererende cellen met behulp van een celcyclus specifieke marker, evenals met behulp van kleine intestinale gewicht, crypte diepte, en villus hoogte als eindpunten. Enkele van de kritische stappen binnen de beschreven methode zijn het verwijderen en wegen van de dunne darm en het nogal complexe software systeem dat wordt voorgesteld voor de meting van deze techniek. Deze methoden hebben de voordelen dat ze niet tijdrovend zijn en dat ze kosteneffectief en gemakkelijk uit te voeren en te meten zijn.
Introduction
Intestinale adaptatie is het natuurlijke compenserende mechanisme dat optreedt wanneer de darm verloren gaat als gevolg van ziekte of chirurgie1,2. Na trauma, de darm ondergaat een Morfometrische en functionele adaptieve reactie, gekenmerkt door de proliferatie van crypte cellen en verhoogde nutriënten absorptie3. Deze stap is van cruciaal belang in herstel, maar slecht begrepen. Experimentele studies van de intestinale adaptieve respons zijn gericht op de veranderingen die zich voordoen na de kleine darm resectie bij muizen, ratten en varkens, maar inzicht in het moleculaire mechanisme achter de adaptieve respons bij andere soorten verwondingen (bijv. chemische of bacteriële) is van cruciaal belang om de identificatie van voedingsstoffen of drugs te vergemakkelijken aanpassing. Experimenteel zijn verschillende benaderingen gebruikt om de complexe moleculaire en cellulaire index van kleine intestinale pathologie te beschrijven, waaronder histopathologische scoring en het meten van de uitkomst van letsel. Desondanks is wat afwezig is in de literatuur een gedetailleerde beschrijving van het uitvoeren van de procedures die nodig zijn om reproduceerbare gegevens te verkrijgen. Bij het identificeren van factoren die betrokken zijn bij de aanpassing, zoals gut hormonen, een gemakkelijk, lage kosten, en reproduceerbare diermodel is gerechtvaardigd en hier raden wij het gebruik van een model van chemotherapie-geïnduceerde intestinale mucositis (CIM).
Een van de eenvoudigste en zeer informatieve eindpunten van zowel letsel en aanpassing is het meten van de massa van de dunne darm (SI). We weten dat een kenmerk van mucositis is apoptosis van enterocyten, tijdafhankelijke villus atrofie en verminderde mitose. Daarom is het onderzoeken van de darm morfologie zeer relevant in preklinische modellen4,5. Bij de mens, een afname van het plasma citrulline, een marker van functionerende enterocyten, correleert met toxiciteit scores en inflammatoire markers6 naast de absorptiecapaciteit7, suggereren dit aminozuur is een uitstekende biomarker van mucositis. Citrulline kan worden gemeten in zowel muizen en ratten, en heeft aangetoond uitstekende correlaties met villus lengte8, Crypt Survival9, en straling-geïnduceerde mucositis10.
Een groot voordeel van het meten van plasma citrulline is de mogelijkheid om herhaalde metingen te verzamelen van een dier. Meervoudige bloedafname bij muizen is echter beperkt tot een totaal bloed volume van 6 μL/g/week en vereist algemene anesthesie. Dit helaas ook beperkt het gebruik van citrulline metingen bij muizen. Bovendien, de meting van citrulline vereist High-Performance vloeibare chromatografie11,12, dat is kostbaar en tijdrovend. Onlangs, we hebben aangetoond dat citrulline niveaus in muizen correleren significant met SI gewicht (p < 0,001) (niet-gepubliceerde gegevens), waardoor citrulline een directe meting reflecterend enterocyten massa. Een beperking tot de meting van het SI-gewicht is de noodzaak om de muizen op te offeren en dus zijn er geen herhaalde metingen binnen dezelfde muis mogelijk. Toch biedt de methode de mogelijkheid om verschillende andere weefsel analyses uit te voeren die gericht zijn op de onderzoeksvraag, en deze feiten kunnen denkbaar zijn voor het extra gebruik van dieren. We raden daarom aan om SI-gewicht te gebruiken als een eenvoudige, goedkope en snelle biomarker voor letsel en aanpassing aan muizen. Om de reproduceerbaarheid en aanvaardbare analytische variatie te garanderen, moeten de darmen zorgvuldig worden verwijderd uit het dier, gespoeld met zout, geleegd en gedroogd vóór het wegen. In dit artikel laten we precies zien hoe deze procedure wordt uitgevoerd.
Een ander kenmerk van mucositis is het verlies van de prolifererende cellen in de crypten en een compenserende hyperproliferatie tijdens de regeneratieve periode3. De cellulaire marker Ki67 is vaak gebruikt om snelle proliferatieve cellen te bepalen door middel van immunohistochemie13. Hoewel Ki67 een eenvoudige marker van proliferatie is, heeft het een neiging tot onnauwkeurigheid omdat Ki67 aanwezig is tijdens alle actieve fasen van de celcyclus (G1, S, G2 en M)14. Specifieke etikettering is essentieel voor het opsporen van replicerende cellen, daarom stellen we voor in situ-integratie van 5-broom-2′-deoxyuridine (BrdU), een synthetisch analoog van thymidine, omdat het grotendeels beperkt is tot het repliceren van cellen in de S-fase15. BrdU wordt geïnjecteerd in de dieren 150 minuten voor het offeren en cellen kunnen vervolgens worden gedetecteerd met immunohistochemie met behulp van BrdU specifieke antilichamen. In deze methode artikel laten we precies zien hoe het gebied van BrdU immunopositive cellen binnen een crypte meten met behulp van een gratis beeld software.
Morfologische en functionele veranderingen worden vaak bestudeerd in 5-FU geïnduceerde mucositis modellen, waar de intestinale adaptatie wordt beoordeeld door villus hoogte en crypte diepte. Tijdens deze studie ontdekten we dat tijdens de acute fase van mucositis, die gelijk is aan de blessure fase, proliferatie gemeten door BrdU-opname niet gecorreleerd is met crypte diepte. In tegenstelling tot deze, crypte diepte is significant gecorreleerd met proliferatie gezien in de reparatiefase van mucositis, 3 tot 5 dagen na inductie. Dit suggereert dat de acute fase van mucositis niet meetbaar is door de crypte diepte alleen. We stellen voor dat bij het gebruik van proliferatie als een eindpunt in de acute fase van mucositis muizen, BrdU-opname bij voorkeur moet worden gebruikt, maar bij het kwantificeren van Hyper proliferatie in het latere stadium tijdens de regeneratieve fase, is de crypte diepte een redelijke alternatief voor de oprichting van BrdU. Het doel van deze studie was om dit model te beschrijven op een manier dat het kan worden gebruikt door alle onderzoekers, zowel op het gebied van oncologie, maar vooral onderzoekers niet bekend met intestinale schademodellen.
Het beschreven model kan worden gebruikt om fenotype transgene modellen volgens de adaptieve respons met behulp van lichaamsgewicht, SI gewicht en crypte diepte als eindpunten. Als voorbeeld laten we hier zien hoe we het model van 5-fluorouracil (5-FU) geïnduceerde mucositis hebben gebruikt in een cellulair knock-out model met onvoldoende L-cel secretie16. Glucagon-achtige peptide-1 (GLP-1) en glucagon-achtige peptide-2 (GLP-2) zijn intestinale hormonen die worden afgescheiden van de enteroendocrine L-cellen in reactie op voedselinname17,18. GLP-2 wordt erkend als een belangrijke factor voor intestinale genezing, de regulering van mucosale apoptosis en de verbetering van de barrièrefunctie van de si19,20,21,22. Op basis van de literatuur veronderstellen we dat endogene hormonen essentieel zijn voor compenserende hyperproliferatie die zich voordoet in de adaptieve reactie na letsel.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier demonstreren we een breed toegankelijke methode om SI-letsel en regeneratie in een muismodel te bestuderen. Een breed scala van preklinische dierlijke modellen van intestinale letsel bestaan, maar het is van vitaal belang dat we begrijpen dat elk model uniek is en dat de eindpunten geschikt moet zijn om de onderzoeksvraag te beantwoorden. Dit model is uitstekend om te studeren adaptieve reactie op letsel, maar de eindpunten moeten worden gewijzigd bij het gebruik van het model als een pre-klinische model van mucosit…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door een onbeperkte subsidie van het Novo Nordisk Center voor fundamenteel metabolisch onderzoek en de Stichting Lundbeck.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
