Важные конечные точки и пролиферативные маркеры для оценки малых кишечных травм и адаптации с помощью мыши модели химиотерапии индуцированного мукозита
Summary
Здесь мы представляем протокол для установления важных конечных точек и пролиферативных маркеров небольших кишечных повреждений и компенсационного гиперраспространения с использованием модели мукозита, вызванного химиотерапией. Мы демонстрируем обнаружение размножающихся клеток с помощью специфического маркера клеточного цикла и использования небольшого кишечного веса, глубины склепа и высоты вилюуса в качестве конечных точек.
Abstract
Кишечная адаптация является естественным компенсационным механизмом, который возникает, когда кишечник теряется из-за травмы. Адаптивные реакции, такие как пролиферация клеток криптов и увеличение поглощения питательных веществ, имеют решающее значение для восстановления, но плохо понимаются. Понимание молекулярного механизма, лежащего в основе адаптивных реакций, имеет решающее значение для облегчения идентификации питательных веществ или лекарств для повышения адаптации. Различные подходы и модели были описаны во всей литературе, но для получения воспроизводимых данных необходим подробный описательный способ существенного выполнения процедур. Здесь мы описываем метод оценки важных конечных точек и пролиферативных маркеров небольших кишечных повреждений и компенсационного гиперраспространения с помощью модели мукозита, вызванного химиотерапией у мышей. Мы демонстрируем обнаружение размножающихся клеток с помощью специфического маркера клеточного цикла, а также использование небольшого кишечного веса, глубины склепа и высоты villus в качестве конечных точек. Некоторые из критических шагов в рамках описанного метода удаления и взвешивания тонкой кишки и довольно сложной программной системы, предложенной для измерения этого метода. Эти методы имеют преимущества, которые они не отнимают много времени, и что они являются экономически эффективными и легко выполнять и измерять.
Introduction
Кишечная адаптация является естественным компенсационным механизмом, который возникает, когда кишечник теряется из-за болезни или операции1,2. После травмы, кишечник проходит морфометрический и функциональный адаптивный ответ, характеризуется пролиферацией клеток склепа и увеличение поглощения питательных веществ3. Этот шаг имеет решающее значение для восстановления, но плохо понимается. Экспериментальные исследования адаптивной реакции кишечника были сосредоточены на изменениях, происходящих после небольшой резекции кишечника у мышей, крыс и свиней, но понимание молекулярного механизма, лежащего в основе адаптивной реакции в других видах травм (например, химических или бактериальных) имеет решающее значение для облегчения идентификации питательных веществ или препаратов для повышения адаптации. Экспериментально для описания сложного молекулярно-клеточного индекса малой кишечной патологии, включая гистопатологический скоринг и измерения исхода травмы, использовались различные подходы. Несмотря на это, в литературе отсутствует подробное описание того, как выполнять процедуры, необходимые для получения воспроизводимых данных. При выявлении факторов, участвующих в адаптации, таких как гормоны кишечника, легко, низкая стоимость, и воспроизводимые модели животных является оправданным, и здесь мы предлагаем использовать модель химиотерапии индуцированного мукозита кишечника (CIM).
Одной из простейших и очень информативных конечных точек как травмы, так и адаптации является измерение массы тонкой кишки (СИ). Мы знаем, что отличительной чертой мукозита является апоптоз энтероцитов, зависимый от времени атрофия вилюуса и снижение митоза. Поэтому изучение морфологии кишечника очень актуально вдоклинических моделях 4,5. У людей, снижение плазмы цитруллин, маркер функционирования энтероцитов, коррелирует с токсичностью оценки и воспалительные маркеры6 в дополнение к абсорфтивной емкости7, предполагая, что эта аминокислота является отличным биомаркером Мукозит. Цитруллин может быть измерен атакжем как у мышей, так иу крыс, и показал отличную корреляцию с длиной 8, выживанием склепа9и радиационным мукозитом10.
Основным преимуществом измерения плазменного цитруллина является способность собирать повторные измерения от одного животного. Тем не менее, несколько проб крови у мышей ограничивается общим объемом крови в размере 6 л/г/неделю и требует общей анестезии. Это, к сожалению, также ограничивает использование цитруллин измерений у мышей. Кроме того, измерение цитруллина требует высокопроизводительной жидкой хроматографии11,12,что является дорогостоящим и трудоемким. Недавно мы показали, что уровни цитруллина у мышей значительно коррелируют с весом SI (p qlt; 0.001) (неопубликованные данные), что делает цитруллин прямым измерением, отражающим массу энтероцита. Ограничение милиенции веса SI является необходимостью для мышей, которые будут принесены в жертву и, таким образом, не повторяющиеся измерения в пределах одной мыши возможны. Тем не менее метод дает возможность провести целый ряд других анализов тканей, направленных на исследовательский вопрос, и эти факты могут предположительно компенсировать дополнительное использование животных. Поэтому мы предлагаем использовать вес СИ как простой, недорогой и быстрый биомаркер травми и адаптации у мышей. Для обеспечения воспроизводимости и приемлемого аналитического изменения кишечник следует тщательно удалить из животного, покраснеть сольнием, опорожнить и высушить перед взвешиванием. В этой статье мы показываем, как именно выполняется эта процедура.
Еще одной отличительной чертой мукозита является потеря размножающихся клеток в склепе и компенсационная гиперпролиферация во время регенеративного периода3. Клеточный маркер Ki67 часто используется для определения быстрых пролиферативных клеток с помощью иммуногистохимии13. Хотя Ki67 является простым маркером распространения, он имеет тенденцию к неточности, как Ki67 присутствует во всех активных фазах клеточного цикла (G1, S, G2, и M)14. Специфическая маркировка имеет важное значение для обнаружения репликации клеток, поэтому мы предлагаем на месте включение 5-бромо-2′-deoxyuridine (BrdU), синтетический аналог тимидина, так как это в значительной степени ограничивается репликации клеток в S-фазе15. BrdU вводят в животных 150 минут до жертвовать и клетки могут затем быть обнаружены с иммуногистохимией используя антитела BrdU специфические. В этой статье метода мы покажем, как именно измерить площадь иммунопозитивных клеток BrdU в склепе с помощью свободного программного обеспечения изображения.
Морфологические и функциональные изменения часто изучаются в моделях 5-FU индуцированного мукозита, где адаптация кишечника оценивается по высоте и глубине склепа. В ходе этого исследования мы обнаружили, что во время острой фазы мукозита, который равен фазе травмы, пролиферация, измеренная включением BrdU, не коррелирует с глубиной крипты. В отличие от этого, глубина склепа значительно коррелирует с распространением, наблюдаемым в фазе ремонта мукозита, через 3-5 дней после индукции. Это говорит о том, что острая фаза мукозита не поддается измерению только глубиной склепа. Мы предлагаем, что при использовании распространения в качестве конечной точки в острой фазе мукозита мышей, BrdU включения предпочтительно использовать, но при количественной гиперраспространения на более поздней стадии во время регенеративной фазы, крипта глубина является разумным альтернативой регистрации BrdU. Цель этого исследования состояла в том, чтобы описать эту модель таким образом, что она может быть использована всеми исследователями, как в области онкологии, но особенно исследователи не знакомы с моделями травм кишечника.
Описанная модель может быть использована для фенотипа трансгенных моделей в соответствии с адаптивной реакцией, используя массу тела, вес SI и глубину склепа в качестве конечных точек. В качестве примера, мы показываем здесь, как мы использовали модель 5-фторурацил (5-FU) индуцированный мукозит в клеточной выбить модели с недостаточной L-клеточной секреции16. Глюкагон-как пептид-1 (GLP-1) и глюкагоноподобный пептид-2 (GLP-2) являются кишечными гормонами, со-секретированными из энтероэндокринных L-клеток в ответ на потребление пищи17,18. GLP-2 признан важным фактором заживления кишечника, регуляции слизистой апоптоза и улучшения барьерной функции СИ19,20,21,22. Основываясь на литературе, мы предположили, что эндогенные гормоны необходимы для компенсационного гиперраспространения, происходящих в адаптивной реакции после травмы.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы демонстрируем широко доступный метод изучения травмы ИИ и регенерации в мышиной модели. Существует широкий спектр доклинических моделей кишечных травм, но очень важно понимать, что каждая модель уникальна и что конечные точки должны быть подходящими для ответа на исследовате…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана неограниченным грантом от Ново Нордиск Центр фундаментальных метаболических исследований и Лундбек Фонда.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
