Kemoterapiye bağlı Mukozinin fare modelini kullanarak küçük bağırsak yaralanmasını ve uyarlamasını değerlendirmek için önemli uç noktalar ve proliferatif Işaretçiler
Summary
Burada, küçük bağırsak hasarının önemli uç noktalarını ve proliferatif belirteçleri ve kemoterapi kaynaklı Mukozit modeli kullanılarak telafi edilen hiperproliferasyonu oluşturmak için bir protokol sunuyoruz. Biz bir hücre döngüsü özel marker kullanarak proliferasyon hücrelerin tespiti ve küçük bağırsak ağırlığı kullanarak göstermek, Crypt derinliği, ve uç noktaları olarak villus yüksekliği.
Abstract
Intestinal adaptasyon, bağırsak travması nedeniyle kaybolduğunda oluşan doğal telafi edici bir mekanizmadır. Crypt hücre proliferasyonu ve artan besin emilimi gibi adaptif tepkiler, kurtarma açısından kritik öneme sahiptir, ancak kötü anlaşılmalıdır. Adaptif yanıtların arkasındaki moleküler mekanizmayı anlamak, adaptasyon geliştirmek için besin veya ilaçların tanımlanması için çok önemlidir. Literatürde farklı yaklaşımlar ve modeller tanımlanmıştır, ancak yeniden üretilebilen veriler elde etmek için prosedürler için ayrıntılı açıklayıcı bir yöntem gereklidir. Burada, küçük bağırsak hasarının önemli uç noktalarını ve proliferatif belirteçleri ve farelerde kemoterapi kaynaklı Mukozit modeli kullanılarak telafi edilen hiperproliferasyonu tahmin etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Biz bir hücre döngüsü belirli marker kullanarak proliferasyon hücrelerin tespiti, yanı sıra küçük bağırsak ağırlığı kullanarak göstermek, Crypt derinliği, ve uç noktaları olarak villus yüksekliği. Açıklanan yöntem içindeki kritik adımlardan bazıları, küçük bağırsak ve bu tekniğin ölçümü için önerilen oldukça karmaşık yazılım sistemi kaldırma ve tartım vardır. Bu yöntemler, onlar zaman alıcı değildir ve maliyet-etkili ve kolay yürütmek ve ölçmek için avantajları vardır.
Introduction
Intestinal adaptasyon, bağırsak hastalığı veya ameliyatı nedeniyle kaybolduğunda oluşan doğal telafi edici bir mekanizmadır1,2. Travma sonrası, bağırsak bir morfometrik ve fonksiyonel adaptif yanıt uğrar, Crypt hücre proliferasyon ve artan besin emilimi ile karakterize3. Bu adım, kurtarma, henüz kötü anlaşılır önemlidir. Bağırsak adaptif tepkisini deneysel çalışmalar fareler, fareler ve domuzlar küçük bağırsak rezeksiyondan sonra meydana gelen değişiklikler üzerinde duruldu, ancak diğer yaralanmalarda adaptif tepki arkasındaki moleküler mekanizmayı anlamak (örn., kimyasal veya bakteriyel) adaptasyon geliştirmek için besin veya ilaçların tanımlanması kolaylaştırmak için çok önemlidir. Deneysel olarak, histopatolojik Puanlama ve yaralanma sonucunu ölçme dahil olmak üzere küçük bağırsak patolojisinin kompleks moleküler ve hücresel indeksi tanımlamak için farklı yaklaşımlar kullanılmıştır. Buna rağmen, literatürden eksik olan şey, tekrarlanabilir veriler elde etmek için gereken yordamları nasıl gerçekleştirebileceğiniz hakkında ayrıntılı bir açıklamasıdır. Bağırsak hormonları, kolay, düşük maliyetli ve yeniden üretilebilen hayvan modeli gibi adaptasyon faktörleri tanımlanırken, burada kemoterapi kaynaklı intestinal Mukozit (CıM) modelini kullanmanızı öneririz.
Hem yaralanma hem de adaptasyon için en basit ve çok bilgilendirici uç noktaların biri ince bağırsak kütlesini ölçmek için (sı). Biliyoruz ki, mukozisin bir damgasını, enterositlerin apoptozis, zamana bağlı villus atrofisi ve azaltılmış mitozis vardır. Bu nedenle, bağırsak morfolojisi incelendiğinde,4,5preklinik modellerde oldukça ilgilidir. İnsanlarda, plazma Citrulline bir düşüş, işleyen bir enterositlerin bir marker, toksisite puanları ve inflamatuar işaretçileri ile ilişkilendirir6 absorptif kapasiteye ek olarak7, bu amino asit öneren mükemmel bir biyomarker olduğunu Mukozit. Citrulline hem fareler ve fareler ölçülür, ve villus uzunluğu8ile mükemmel korelasyonlar göstermiştir, Crypt Survival9, ve radyasyon kaynaklı Mukozit10.
Plazma sitrulin ölçme büyük bir avantajı bir hayvan tekrarlayan ölçümler toplamak için yeteneğidir. Ancak, farelerde birden fazla kan örnekleme 6 μL/g/hafta toplam kan hacmine sınırlıdır ve genel anestezisi gerektirir. Bu maalesef aynı zamanda fareler sitrulline ölçümleri kullanımını sınırlar. Ayrıca, sitrulin ölçümü, pahalı ve zaman alıcı olan yüksek performanslı sıvı kromatografi11,12gerektirir. Son zamanlarda, farelerdeki sitrulin düzeylerinin sı ağırlığı (p < 0,001) (yayınlanmamış veriler) ile önemli ölçüde korelasyon gösterdiğini, sitrulin enterocayt kütlesini yansıtan doğrudan bir ölçüm yapmasını göstermiştir. Sı ağırlığı ölçümü için bir sınırlama farelerin feda edilmesi zorunluluktur ve böylece aynı fare içinde tekrarlanan ölçümler mümkün değildir. Yine de Yöntem Araştırma sorusu yönlendirilmiş diğer doku analizleri çeşitli gerçekleştirmek için imkanı sağlar, ve bu gerçekler makul hayvanların ek kullanımı için telafi edebilirsiniz. Biz, bu nedenle, kolay, düşük maliyetli ve hızlı yaralanma ve fare adaptasyon biyomarker sı ağırlığı kullanarak öneririz. Tekrarlanabilirlik ve kabul edilebilir analitik varyasyonu sağlamak için, bağırsak dikkatli bir şekilde hayvandan çıkarılmalı, tuz ile temizlendi, boşaltılmış ve Tartmadan önce kurutulur. Bu makalede, bu yordamın tam olarak nasıl gerçekleştirildiği gösterilir.
Başka bir Mukozit damgasını, kripterlerde proliferasyon hücrelerinin kaybı ve rejeneratif dönemde telafi edici bir hiperproliferasyonu3. Hücresel Marker Ki67, İmmünohistokimya13ile hızlı proliferatif hücreleri belirlemek için sıklıkla kullanılmıştır. Ki67 proliferasyon basit bir marker olsa da, Ki67 olarak hücre döngüsünün tüm aktif aşamaları (G1, S, G2 ve M)14olduğu gibi hassas bir eğilim vardır. Belirli etiketleme, çoğalan hücreleri tespit etmek için gereklidir, bu nedenle S-faz15‘ teki hücreleri çoğalarak büyük ölçüde kısıtlandığı için, 5-Bromo-2’-deoxyuridine (BrdU), trimidinin sentetik bir analininin situ birleştirmesi öneriyoruz. BrdU hayvanlarda enjekte edilir 150 ödün vermeden önce ve hücreler daha sonra BrdU spesifik antikorlar kullanarak immünhistokimya ile tespit edilebilir. Bu yöntem makalesinde, ücretsiz bir görüntü yazılımı kullanarak bir crypt içinde BrdU immünopozitif hücrelerin alanını ölçmek için tam olarak nasıl gösterir.
Morfolojik ve fonksiyonel değişiklikler genellikle intestinal adaptasyon villus yüksekliği ve Crypt derinliği tarafından değerlendirilir 5-FU indüklenen Mukozit modelleri, incelenmiştir. Bu çalışmada, yaralanma aşamasına eşit olan Mukozit akut fazında, BrdU birleşmesi ile ölçülen proliferasyon Crypt derinliği ile ilişkili değildir. Bunun aksine, Crypt derinliği, İndüksiyondan 3 ila 5 gün sonra Mukozit onarımı aşamasında görülen proliferasyon ile önemli ölçüde ilişkilidir. Bu, mukozitte akut fazın tek başına derinlik ile ölçülebilir olmadığını göstermektedir. Mukozit fareler akut aşamasında bir uç nokta olarak proliferasyon kullanırken, BrdU kuruluş tercihen kullanılmalıdır ancak rejeneratif faz sırasında daha sonraki aşamada hiperproliferasyon niceleme zaman, Crypt derinliği makul bir BrdU kuruluş alternatifi. Bu çalışmanın amacı, bu modeli tüm araştırmacılar tarafından, hem onkoloji alanında hem de özellikle bağırsak yaralanması modellerini aşina olmayan araştırmacılar tarafından kullanılabilecek şekilde açıklamak oldu.
Açıklanan model vücut ağırlığı, sı ağırlığı ve uç noktaları olarak Crypt derinliği kullanarak uyarlanabilir tepkiyle göre fenotip transgenik modeller için kullanılabilir. Örnek olarak, burada 5-fluorourasil (5-FU) kaynaklı Mukozit modelinin yetersiz L-hücreli salgılanması16ile hücresel bir vuruş modelinde nasıl kullanıldığını göstereceğiz. Glukagon-like peptid-1 (GLP-1) ve glukagon-benzeri peptid-2 (GLP-2), gıda alımı için yanıt olarak enteroendokrin L-hücrelerinden ortak salgılanan intestinal hormonlardır17,18. GLP-2 intestinal şifa için önemli bir faktör olarak kabul edilir, mukozal apoptozis düzenlenmesi ve bariyer işlevinin iyileştirilmesi sı19,20,21,22. Literatüre dayanarak, endojen hormonların yaralanmadan sonra uyarlanabilir tepki içinde meydana gelen telafi edici hiperproliferasyon için gerekli olduğunu hipotez.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bir fare modelinde sı yaralanma ve rejenerasyon çalışması için yaygın olarak erişilebilir bir yöntem göstermektedir. Bağırsak yaralanması preklinik hayvan modelleri çok çeşitli var, ama biz her model benzersiz ve uç noktaları araştırma sorusu cevaplamak için uygun olması gerektiğini anlamak hayati önem taşımaktadır. Bu model yaralanmaya adaptif yanıtı incelemek için mükemmeldir, ancak modeli Mukozit öncesi klinik modeli olarak kullanırken uç noktalar değiştirilmesi gerekir. Anc…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Novo Nordisk merkezi temel metabolik araştırma ve Lundbeck Vakfı ‘ndan sınırsız hibe tarafından destekleniyordu.
Materials
| 5-Fluorouracil | Hospira Nordic AB, Sweden | 137853 | |
| Ketaminol®Vet | Merck, New Jersey, USA | 511485 | |
| Rompun®Vet Xylazine | Rompunvet, Bayer, Leverkusen, Germany. | 148999 | |
| 10% nautral formalin buffer | Cell Path Ltd, Powys, United Kingdom | BAF-5000-08A | |
| HistoClear | National Diagnostics, United Kingdom | HS-200 | |
| Pertex | HistoLab®, Sweden | 840 | |
| BrdU | Sigma-Aldrich, Germany. | B5002 | |
| Tris/EDTA pH 9 buffer | Thermofisher scientific, Denmark | TA-125-PM4X | |
| Peroxide Block | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Rodent Block buffer | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| Monoclonal mouse anti-BrdU antibody | Thermofisher Scientific, Denmark. | MA1-81890 | |
| Lab Vision Antibody Diluent OP Quanto | Thermofisher Scientific, Denmark. | TA-125-ADQ | |
| Horseradish peroxidase | Ultravision Quanto Mouse on Mouse kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TL-060-QHDM | |
| DAB Quanto Substrate | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| DAB Quanto Chromogen | DAB Substrate Kit, Thermofisher Scientific, Denmark | TA-125-QHDX | |
| Zen Lite Software (Blue edition) | Carl Zeiss A/S | https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/microscope-software/zen-lite.html | |
| ImageJ Software | LOCI, University of Wisconsin | https://imagej.nih.gov/ij/ |
References
- Weinstein, L. D., Shoemaker, C. P., Hersh, T., Wright, H. K. Enhanced intestinal absorption after small bowel resection in man. The Archives of Surgery. 99 (5), 560-562 (1969).
- Helmrath, M. A., VanderKolk, W. E., Can, G., Erwin, C. R., Warner, B. W. Intestinal adaptation following massive small bowel resection in the mouse. Journal of the American College of Surgeons. 183 (5), 441-449 (1996).
- Kissow, H., et al. Exogenous glucagon-like peptide-2 (GLP-2) prevents chemotherapy-induced mucositis in rat small intestine. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 70 (1), 39-48 (2012).
- Kaczmarek, A., Brinkman, B. M., Heyndrickx, L., Vandenabeele, P., Krysko, D. V. Severity of doxorubicin-induced small intestinal mucositis is regulated by the TLR-2 and TLR-9 pathways. The Journal of Pathology. 226 (4), 598-608 (2012).
- Pontoppidan, P. L., et al. Intestinal response to myeloablative chemotherapy in piglets. Experimental Biology and Medicine. 239 (1), 94-104 (2014).
- Pontoppidan, P. L., et al. Associations between gastrointestinal toxicity, micro RNA and cytokine production in patients undergoing myeloablative allogeneic stem cell transplantation. International Immunopharmacology. 25 (1), 180-188 (2015).
- Crenn, P., Messing, B., Cynober, L. Citrulline as a biomarker of intestinal failure due to enterocyte mass reduction. Clinical Nutrition. 27 (3), 328-339 (2008).
- Fijlstra, M., et al. Lactose maldigestion during methotrexate-induced gastrointestinal mucositis in a rat model. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 300 (2), G283-G291 (2011).
- Jones, J. W., et al. Citrulline as a Biomarker in the Murine Total-Body Irradiation Model: Correlation of Circulating and Tissue Citrulline to Small Intestine Epithelial Histopathology. Health Physics. 109 (5), 452-465 (2015).
- Lutgens, L. C., et al. Citrulline: a physiologic marker enabling quantitation and monitoring of epithelial radiation-induced small bowel damage. International Journal of Radiation Oncology, Biology, Physics. 57 (4), 1067-1074 (2003).
- Demacker, P. N., et al. Plasma citrulline measurement using UPLC tandem mass-spectrometry to determine small intestinal enterocyte pathology. Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in the Biomedical and Life Sciences. 877 (4), 387-392 (2009).
- van Eijk, H. M., Rooyakkers, D. R., Deutz, N. E. Rapid routine determination of amino acids in plasma by high-performance liquid chromatography with a 2-3 microns Spherisorb ODS II column. Journal of Chromatography. 620 (1), 143-148 (1993).
- Scholzen, T., Gerdes, J. The Ki-67 protein: from the known and the unknown. Journal of Cellular Physiology. 182 (3), 311-322 (2000).
- Khoshyomn, S., Lew, S., DeMattia, J., Singer, E. B., Penar, P. L. Brain tumor invasion rate measured in vitro does not correlate with Ki-67 expression. Journal of Neuro-Oncology. 45 (2), 111-116 (1999).
- Matatall, K. A., Kadmon, C. S., King, K. Y. Detecting Hematopoietic Stem Cell Proliferation Using BrdU Incorporation. Methods in Molecular Biology. , 91-103 (2018).
- Hytting-Andreasen, R., et al. Endogenous glucagon-like peptide- 1 and 2 are essential for regeneration after acute intestinal injury in mice. PLoS One. 13 (6), e0198046 (2018).
- Elliott, R. M., et al. Glucagon-like peptide-1 (7-36)amide and glucose-dependent insulinotropic polypeptide secretion in response to nutrient ingestion in man: acute post-prandial and 24-h secretion patterns. Journal of Endocrinology. 138 (7-36), 159-166 (1993).
- Orskov, C., Wettergren, A., Holst, J. J. Secretion of the incretin hormones glucagon-like peptide-1 and gastric inhibitory polypeptide correlates with insulin secretion in normal man throughout the day. Scandinavian Journal of Gastroenterology. 31 (7), 665-670 (1996).
- Drucker, D. J., Erlich, P., Asa, S. L., Brubaker, P. L. Induction of intestinal epithelial proliferation by glucagon-like peptide 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (15), 7911-7916 (1996).
- Lee, S. J., et al. Disruption of the murine Glp2r impairs Paneth cell function and increases susceptibility to small bowel enteritis. Endocrinology. 153 (3), 1141-1151 (2012).
- Shin, E. D., Estall, J. L., Izzo, A., Drucker, D. J., Brubaker, P. L. Mucosal Adaptation to Enteral Nutrients is Dependent on the Physiologic Actions of Glucagon-Like Peptide-2 in Mice. Gastroenterology. 128 (5), 1340-1353 (2005).
- Tsai, C. H., et al. Intestinal growth-promoting properties of glucagon-like peptide-2 in mice. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 273 (1), E77-E84 (1997).
- Sangild, P. T., Shen, R. L., Pontoppidan, P., Rathe, M. Animal models of chemotherapy-induced mucositis: translational relevance and challenges. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver Physiology. 314 (2), G231-G246 (2017).
- Gibson, R. J., et al. Irinotecan causes severe small intestinal damage, as well as colonic damage, in the rat with implanted breast cancer. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 18 (9), 1095-1100 (2003).
- Zhang, C., et al. Bone marrow stromal cells upregulate expression of bone morphogenetic proteins 2 and 4, gap junction protein connexin-43 and synaptophysin after stroke in rats. Neuroscience. 141 (2), 687-695 (2006).
- Biebl, M., Cooper, C. M., Winkler, J., Nl Kuhn, H. G. J. Analysis of neurogenesis and programmed cell death reveals a self-renewing capacity in the adult rat brain. Neuroscience Letters. 291 (1), 17-20 (2000).
