مراقبة الدائرة تنظيم محدد من خلايا السلائف العصبية فرس النهر الكبار
Summary
الهدف من هذا البروتوكول هو وصف نهج لتحليل سلوك الخلايا الجذعية العصبية الكبار / الخلايا السلف ردا على التلاعب الكيميائي من دائرة عصبية محلية محددة.
Abstract
تكوين الأعصاب لدى البالغين هو عملية ديناميكية تقوم من خلالها الخلايا الجذعية العصبية (NSCs) التي تم تنشيطها حديثًا في المنطقة تحت الحبيبية (SGZ) من الجبس الدنتات (DG) بإنشاء خلايا عصبية جديدة، والتي تندمج في دائرة عصبية موجودة وتساهم في وظائف فرس النهر المحددة . الأهم من ذلك، تكوين الأعصاب الكبار هو عرضة للغاية للمحفزات البيئية، والذي يسمح لتنظيم تعتمد على النشاط من مختلف الوظائف المعرفية. مجموعة واسعة من الدوائر العصبية من مناطق الدماغ المختلفة ينظم هذه الوظائف المعرفية المعقدة. ولذلك من المهم أن نفهم كيف تنظم الدوائر العصبية المحددة تكوين الأعصاب للبالغين. هنا، ونحن نصف بروتوكول للتعامل مع نشاط الدائرة العصبية باستخدام مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل مصمم الأدوية (DREADDs) التكنولوجيا التي تنظم NSCs وذرية حديثي الولادة في القوارض. ويشمل هذا البروتوكول الشامل حقن الجسيمات الفيروسية المجسمة، والتحفيز الكيميائي للدوائر العصبية المحددة، والإدارة التناظرية الثيميدين، ومعالجة الأنسجة، ووضع العلامات المناعية، والتصوير البؤري، والتصوير تحليل مراحل مختلفة من الخلايا العصبية السلائف. يوفر هذا البروتوكول تعليمات مفصلة حول تقنيات استرجاع المستضد المستخدمة لتصور NSCs وذريتها ويصف طريقة بسيطة، ولكنها فعالة لتعديل دوائر الدماغ باستخدام كلوزابين N-أكسيد (CNO) أو CNO التي تحتوي على مياه الشرب و الفيروسات التي تعبر عن الفزع. تكمن قوة هذا البروتوكول في قدرته على التكيف لدراسة مجموعة متنوعة من الدوائر العصبية التي تؤثر على تكوين الأعصاب للبالغين المستمدة من NSCs.
Introduction
تكوين الأعصاب للبالغين هو عملية بيولوجية يتم من خلالها ولادة الخلايا العصبية الجديدة في شخص بالغ ودمجها في الشبكات العصبية القائمة1. في البشر ، تحدث هذه العملية في سايروس dentate (DG) من الحصين ، حيث يولد حوالي 1400 خلية جديدة كل يوم2. هذه الخلايا موجودة في الجزء الداخلي من المديرية العامة، التي تأوي محراب عصبي، يسمى المنطقة تحت الحبيبية (SGZ). هنا، تخضع الخلايا الجذعية العصبية البالغة (NSCs) لعملية تنموية معقدة لتصبح خلايا عصبية تعمل بكامل طاقتها تساهم في تنظيم وظائف الدماغ المحددة، بما في ذلك التعلم والذاكرة، وتنظيم المزاج، واستجابة الإجهاد3 ،4،5،6. للتأثير على السلوكيات، يتم تنظيم NSCs الكبار بشكل كبير من قبل مختلف المحفزات الخارجية بطريقة تعتمد على النشاط من خلال الاستجابة لمجموعة من الإشارات الكيميائية المحلية والبعيدة. وتشمل هذه العظة الكيميائية الناقلات العصبية وneuromodulators والعمل بطريقة محددة دائرة من مختلف مناطق الدماغ. والأهم من ذلك، أن التقارب الواسع بين هذه الدوائر الكيميائية على النقاط القومية الوطنية يسمح بتنظيم فريد ودقيق لتفعيل الخلايا الجذعية، والتمايز، وقرارات المصير.
واحدة من أكثر الطرق فعالية لاستجواب تنظيم الدائرة من NSCs الكبار في الجسم الحي هو عن طريق الجمع بين تحليل الفلورة المناعية مع التلاعب الدائرة واسعة. تحليل الفلورة المناعية للبالغين NSCs هو تقنية تستخدم عادة، حيث يتم استخدام الأجسام المضادة ضد علامات جزيئية محددة للإشارة إلى مرحلة النمو من NSCs الكبار. وتشمل هذه العلامات: العشين كخلية غليا شعاعي وعلامة الذرية العصبية في وقت مبكر، Tbr2 كعلامة السلف المتوسطة، وdcx كneuroblast وعلامة الخلايا العصبية غير ناضجة7. بالإضافة إلى ذلك، من خلال إدارة نظائر الثيميدين مثل BrdU، سيدو، إدو، وإدو، يمكن تسمية السكان الخلية التي تمر مرحلة S بشكل فردي وتصور8،9،10. ومن خلال الجمع بين هذين النهجين، يمكن التحقيق في مجموعة واسعة من الأسئلة تتراوح بين كيفية تنظيم الانتشار في مراحل تنموية محددة، وكيفية تأثير العظة المختلفة على تمايز مجلس الأمن القومي وتكوين الأعصاب.
توجد عدة خيارات للتعامل بفعالية مع الدوائر العصبية بما في ذلك التحفيز الكهربائي، علم الوراثة البصرية، وعلم الوراثة الكيميائية، ولكل منها مزاياها وعيوبها الخاصة. التحفيز الكهربائي ينطوي على عملية جراحية واسعة النطاق حيث يتم زرع الأقطاب الكهربائية إلى منطقة الدماغ المحددة التي تستخدم في وقت لاحق لنقل الإشارات الكهربائية لتعديل منطقة الدماغ المستهدفة. ومع ذلك، يفتقر هذا النهج إلى خصوصية الدوائر الخلوية والدوائر على حد سواء. علم الوراثة البصرية ينطوي على تسليم الجسيمات الفيروسية التي ترميز مستقبلات تنشيط الضوء التي يتم تحفيزها بواسطة الليزر المنبعث من خلال الألياف البصرية المزروعة، ولكن يتطلب التلاعب واسعة النطاق، وتكلفة كبيرة، والعمليات الجراحية المعقدة11. علم الوراثة الكيميائية ينطوي على تسليم الجسيمات الفيروسية التي ترميز مستقبلات مصمم تفعيلها حصرا من قبل الأدوية مصمم أو DREADDs، والتي يتم تفعيلها في وقت لاحق من قبل ليجان محددة وخاملة بيولوجيا المعروفة باسم كلوزابين N-أكسيد (CNO)12 . ميزة استخدام DREADDs للتعامل مع الدوائر العصبية المحلية التي تنظم NSCs الكبار يكمن في سهولة وطرق مختلفة من إدارة CNO. وهذا يسمح لنهج أقل استهلاكا للوقت مع انخفاض التعامل مع الحيوانات، والتي هي قابلة للتكيف بسهولة للدراسات على المدى الطويل لتعديل الدوائر العصبية.
النهج الموصوف في هذا البروتوكول هو مجموعة شاملة من مختلف البروتوكولات المطلوبة لاستجواب بنجاح تنظيم الدائرة من تكوين الأعصاب فرس النهر الكبار الذي يجمع بين كل من تقنيات الفلورة المناعية والتلاعب الدائرة باستخدام علم الوراثة الكيميائية. الطريقة الموصوفة في البروتوكول التالي مناسبة لتحفيز أو تثبيط دائرة واحدة أو متعددة في وقت واحد في الجسم الحي لتحديد وظيفتها التنظيمية على تكوين الأعصاب الكبار. وأفضل استخدام لهذا النهج هو إذا لم تكن المسألة بحاجة إلى درجة عالية من الدقة الزمنية. الأسئلة التي تتطلب السيطرة الزمنية الدقيقة للتحفيز / تثبيط على تردد معين، يمكن معالجتها بشكل أفضل باستخدام علم الوراثة البصرية13،14. النهج الموصوف هنا يتم تكييفه بسهولة للدراسات طويلة الأجل مع الحد الأدنى من التعامل مع الحيوانات خاصة عندما يكون الإجهاد مصدر قلق كبير.
Protocol
Representative Results
Discussion
الهدف من هذا البروتوكول هو تقييم كيفية التلاعب الدوائر العصبية محددة ينظم تكوين الأعصاب فرس النهر الكبار في الجسم الحي باستخدام سلسلة من تقنيات الكيمياء المناعية. تنظيم النشاط المعتمد على النشاط من تكوين الأعصاب الكبار بوساطة دوائر عصبية محددة هو تقنية قيمة مع إمكانية كبيرة لإجراء تعدي?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تلقى L.J.Q. الدعم من المعهد الوطني للصحة العقلية التابع للمعاهد الوطنية للصحة في إطار ملحق التنوع R01MH111773، فضلا عن منحة تدريبية T32 T32T007431-20. تم دعم هذا المشروع من المنح المقدمة إلى J.S. من NIH (MH111773, AG058160, و NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
