Regulación específica del circuito de ensayo de células precursoras neuronales hipocampales adultas
Summary
El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para analizar el comportamiento de las células madre/progenitoras neurales adultas en respuesta a la manipulación quimiogenética de un circuito neural local específico.
Abstract
La neurogénesis adulta es un proceso dinámico mediante el cual las células madre neurales recién activadas (NSC) en la zona subgranular (SGZ) del gyrus dentado (DG) generan nuevas neuronas, que se integran en un circuito neural existente y contribuyen a funciones específicas del hipocampo . Es importante destacar que la neurogénesis adulta es altamente susceptible a los estímulos ambientales, lo que permite la regulación dependiente de la actividad de varias funciones cognitivas. Una amplia gama de circuitos neuronales de varias regiones cerebrales orquesta estas complejas funciones cognitivas. Por lo tanto, es importante entender cómo los circuitos neuronales específicos regulan la neurogénesis adulta. Aquí, describimos un protocolo para manipular la actividad del circuito neural utilizando el receptor de diseño activado exclusivamente por la tecnología de drogas de diseño (DREADD) que regula los NSC y la progenie neonatal en roedores. Este protocolo integral incluye inyección estereotaxcócica de partículas virales, estimulación quimiogenética de circuitos neuronales específicos, administración analógica de timidina, procesamiento de tejidos, etiquetado de inmunofluorescencia, imágenes confocales e imágenes análisis de varias etapas de las células precursoras neuronales. Este protocolo proporciona instrucciones detalladas sobre las técnicas de recuperación de antígenos utilizadas para visualizar los NSC y su progenie y describe una forma simple, pero eficaz de modular los circuitos cerebrales utilizando el óxido N de clozapina (CNO) o el agua potable que contiene CNO y Virus que expresan dREADDs. La fuerza de este protocolo radica en su adaptabilidad para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales que influyen en la neurogénesis adulta derivada de los NSC.
Introduction
La neurogénesis adulta es un proceso biológico por el cual nacen nuevas neuronas en un adulto e integradas en las redes neuronales existentes1. En los seres humanos, este proceso se produce en el gyrus dentalado (DG)del hipocampo, donde nacen alrededor de 1.400 nuevas células cada día 2. Estas células residen en la parte interna de la DG, que alberga un nicho neurogénico, llamado zona subgranular (SGZ). Aquí, las células madre neurales adultas hipocampales (NSC) se someten a un complejo proceso de desarrollo para convertirse en neuronas completamente funcionales que contribuyen a la regulación de funciones cerebrales específicas, incluyendo el aprendizaje y la memoria, regulación del estado de ánimo, y la respuesta al estrés3 ,4,5,6. Para influir en los comportamientos, los SCN adultos están altamente regulados por varios estímulos externos de una manera dependiente de la actividad respondiendo a una serie de señales químicas locales y distales. Estas señales químicas incluyen neurotransmisores y neuromoduladores y actúan de una manera específica de circuito de varias regiones cerebrales. Es importante destacar que la convergencia de circuito según estas señales químicas en los SCN permite una regulación única y precisa de las decisiones de activación, diferenciación y destino de células madre.
Una de las formas más efectivas de interrogar la regulación del circuito de los NSC adultos in vivo es emparejando el análisis de inmunofluorescencia con manipulaciones de circuitos anchos. El análisis de inmunofluorescencia de los SCN adultos es una técnica comúnmente utilizada, donde los anticuerpos contra marcadores moleculares específicos se utilizan para indicar la etapa de desarrollo de los SCN adultos. Estos marcadores incluyen: nestin como célula de glia radial y marcador de progenitor neural temprano, Tbr2 como marcadorde progenitor intermedio, y dcx como marcador de neurona neuroblast e inmaduro 7. Además, mediante la administración de análogos de timidina como BrdU, CidU, Idu, y Edu, las poblaciones celulares sometidas a la fase S se pueden etiquetar y visualizar individualmente8,9,10. Mediante la combinación de estos dos enfoques, se puede investigar una amplia gama de preguntas que van desde cómo se regula la proliferación en etapas específicas del desarrollo, hasta cómo diversas señales afectan a la diferenciación de nSC y la neurogénesis.
Existen varias opciones para manipular eficazmente los circuitos neuronales, incluyendo la estimulación eléctrica, la optogenética y la quimiogenética, cada uno con sus propias ventajas y desventajas. La estimulación eléctrica implica una cirugía extensa donde los electrodos se implantan en una región cerebral específica que más tarde se utilizan para transmitir señales eléctricas para modular una región cerebral dirigida. Sin embargo, este enfoque carece de especificidad celular y de circuito. La optogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor activado por luz que es estimulado por un láser emitido a través de una fibra óptica implantada, pero requiere manipulaciones extensas, gran costo y cirugías complejas11. La quimiogenética implica la entrega de partículas virales que codifican un receptor de diseño activado exclusivamente por fármacos de diseño o DREADD, que posteriormente son activados por un ligando específico y biológicamente inerte conocido como óxido N de clozapina (CNO)12 . La ventaja de utilizar DREADD para manipular circuitos neuronales locales que regulan los SCN adultos radica en la facilidad y varias rutas de administración de CNO. Esto permite un enfoque menos lento con un manejo animal reducido, que es fácilmente adaptable para estudios a largo plazo para modular los circuitos neuronales.
El enfoque descrito en este protocolo es una colección completa de varios protocolos necesarios para interrogar con éxito la regulación del circuito de la neurogénesis del hipocampo adulto que combina tanto técnicas de inmunofluorescencia como manipulaciones de circuitos uso de la quimiogenética. El método descrito en el siguiente protocolo es adecuado para estimular o inhibir uno o varios circuitos simultáneamente in vivo para determinar su función reguladora en la neurogénesis adulta. Este enfoque se utiliza mejor si la pregunta no necesita un alto grado de resolución temporal. Las preguntas que requieren un control temporal preciso de la estimulación/inhibición a una frecuencia determinada, pueden abordarse mejor utilizando optogenética13,14. El enfoque descrito aquí se adapta fácilmente para estudios a largo plazo con un manejo mínimo de animales, especialmente cuando el estrés es una preocupación importante.
Protocol
Representative Results
Discussion
El objetivo de este protocolo es evaluar cómo la manipulación de circuitos neuronales específicos regula la neurogénesis hipocampal en adultos in vivo utilizando una serie de técnicas de inmunohistoquímica. Decir regulación dependiente de la actividad de la neurogénesis adulta mediada por circuitos neuronales específicos es una técnica valiosa con gran potencial para modificaciones para estudiar una amplia gama de circuitos neuronales. El éxito de este tipo de experimentos depende de múltiples factores, inclu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. fue apoyado por el Instituto Nacional de Salud Mental de los Institutos Nacionales de Salud bajo suplemento de diversidad R01MH111773, así como una beca de capacitación T32TS07431-20. Este proyecto fue apoyado por subvenciones otorgadas a J.S. de NIH (MH111773, AG058160 y NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
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