成人海馬神経前駆細胞のアッセイ回路特異的調節
Summary
このプロトコルの目的は、特定の局所神経回路の化学的操作に応答して成人神経幹細胞/前駆細胞の挙動を分析するアプローチを記述することである。
Abstract
成体神経新生は、歯状ジャイル(DG)の顆粒帯(SGZ)で新たに活性化された神経幹細胞(NSC)が新しいニューロンを生成し、既存の神経回路に統合し、特定の海馬機能に寄与する動的なプロセスです。.重要なことに、成人の神経新生は環境刺激の影響を非常に受けやすく、様々な認知機能の活性依存調節を可能にする。様々な脳領域からの神経回路の広大な範囲は、これらの複雑な認知機能を調整します。したがって、特定の神経回路が成人の神経新生を調節する方法を理解することが重要です。ここでは、げっ歯類のNSCと新生児の子孫を調節するデザイナー薬(DREADDs)技術によって排他的に活性化されるデザイナー受容体を用いて神経回路活動を操作するプロトコルについて説明する。この包括的なプロトコルには、ウイルス粒子の立体注射、特定の神経回路の化学的刺激、チミジンアナログ投与、組織処理、免疫蛍光標識、共焦点イメージング、およびイメージングが含まれます。神経前駆細胞の様々な段階の分析。このプロトコルは、NSCとその子孫を視覚化するために使用される抗原検索技術に関する詳細な指示を提供し、クロザピンN-酸化物(CNO)またはCNO含有飲料水を使用して脳回路を調節する簡単で効果的な方法を説明し、DREADDs 発現ウイルス。このプロトコルの強みは、NSCに由来する成人の神経新生に影響を与える多様な神経回路を研究する適応性にあります。
Introduction
成人神経新生は、新しいニューロンが成人で生まれ、既存のニューラルネットワーク1に統合される生物学的プロセスである。ヒトでは、このプロセスは海馬の歯状ジャイル(DG)で起こり、そこでは毎日約1,400個の新しい細胞が2日に生まれる。これらの細胞は、神経原性ニッチを有するDGの内側の部分に存在し、粒状帯(SGZ)と呼ぶ。ここでは、海馬成人神経幹細胞(NSC)は、学習と記憶、気分調節、ストレス応答を含む特定の脳機能の調節に寄与する完全に機能するニューロンになるために複雑な発達過程を経る3 ,4,5,6.行動に影響を与えるために、成人NSCは、局所的および遠位的な化学的手がかりの配列に応答することにより、活動依存的な方法で様々な外部刺激によって高度に規制されています。これらの化学的手がかりは、神経伝達物質と神経調節剤を含み、様々な脳領域から回路固有の方法で作用します。重要なことに、NSC上のこれらの化学的手がかりの回路広い収束は、幹細胞の活性化、分化、および運命の決定のユニークで正確な調節を可能にします。
生体内の成人NSCの回路調節を調知する最も効果的な方法の1つは、免疫蛍光解析と回路広い操作を組み合わせることによってです。成体NSCの免疫蛍光分析は、特定の分子マーカーに対する抗体が成人NSCの発達段階を示すために使用される一般的に利用される技術である。これらのマーカーには、ラジアルグリア細胞および初期神経前駆マーカーとしてのネスチン、中間前駆マーカーとしてのTbr2、神経芽細胞および未熟ニューロンマーカー7としてのdcxが含まれる。さらに、BrdU、CidU、Idu、およびEduなどのチミジン類似体を投与することにより、S相を受けている細胞集団を個別に標識および可視化することができ、8、9、10である。これら2つのアプローチを組み合わせることで、特定の発達段階での増殖がどのように調節されるのか、様々な手がかりがNSC分化や神経新生にどのように影響するかまで、幅広い疑問を調査することができます。
電気刺激、光遺伝学、化学遺伝学などの神経回路を効果的に操作するには、それぞれに長所と短所を持ついくつかのオプションがあります。電気刺激は、電極が後で標的脳領域を調節するために電気信号を送信するために使用される特定の脳領域に移植される広範な手術を伴う。ただし、このアプローチにはセルラーと回路の両方の特異性が欠けています。光遺伝学は、埋め込まれた光ファイバーを通して放出されるレーザーによって刺激される光活性化受容体をコードするウイルス粒子の送達を含むが、広範な操作、大きなコスト、および複雑な手術を必要とする11。化学遺伝学は、デザイナー薬またはDREADDsによって排他的に活性化されるデザイナー受容体をコードするウイルス粒子の送達を含み、その後、クロザピンN-オキシド(CNO)として知られている特定の生物学的不活性リガンドによって活性化される12.DREADDを利用して成人NSCを調節する局所的な神経回路を操作する利点は、CNO管理の容易さと様々な経路にあります。これにより、動物の取り扱いを減らして時間のかかるアプローチが可能となり、神経回路を調節するための長期研究に容易に適応できます。
このプロトコルに記載されているアプローチは、免疫蛍光技術と回路操作の両方を組み合わせた成人海馬神経新生の回路調節を正常に調知するために必要な様々なプロトコルの包括的なコレクションです。化学遺伝学を使用して。以下のプロトコルに記載の方法は、成体神経新生に対するそれらの調節機能を決定するために、生体内で同時に1つまたは複数の回路を刺激または阻害するのに適している。この方法は、質問に高度な時間分解能が必要ない場合に最適です。特定の周波数での刺激/阻害の正確な時間的制御を必要とする質問は、光遺伝学13、14を使用してより良い対処することができる。ここで説明するアプローチは、特にストレスが主要な懸念事項である場合、最小限の動物の取り扱いを伴う長期的な研究に容易に適合する。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルの目的は、特定の神経回路を操作すると、一連の免疫組織化学技術を使用して生体内の成体海馬神経新生を調節する方法を評価することです。特定の神経回路によって媒介される成人神経新生のアッセイ活性依存調節は、多様な神経回路を研究するための修飾のための大きな可能性を有する貴重な技術である。これらのタイプの実験の成功は、正確なウイルス送達、所望の操?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q.は、ダイバーシティサプリメントR01MH111773の下で国立衛生研究所の精神保健研究所によってサポートされただけでなく、T32トレーニング助成金T32NS007431-20。このプロジェクトは、NIH(MH111773、AG058160、NS104530)からJ.S.に授与された助成金から支援されました。
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
