Assaying krets specifik reglering av vuxna hippocampal neurala prekursorer celler
Summary
Målet med detta protokoll är att beskriva en metod för att analysera beteendet hos vuxna neurala Stem/stamceller som svar på chemogenetisk manipulation av en specifik lokal neurala krets.
Abstract
Adult neurogenes är en dynamisk process genom vilken nyligen aktiverade neurala stamceller (NSCs) i subgranulat zon (SGZ) av dentate gyrus (DG) generera nya nervceller, som integreras i en befintlig neurala krets och bidra till specifika Hippocampus funktioner . Viktigt, vuxna neurogenes är mycket mottagliga för miljömässiga stimuli, som möjliggör aktivitetsberoende reglering av olika kognitiva funktioner. Ett brett spektrum av neurala kretsar från olika hjärnregioner iscengör dessa komplexa kognitiva funktioner. Det är därför viktigt att förstå hur specifika neurala kretsar reglera vuxna neurogenes. Här, vi beskriver ett protokoll för att manipulera neurala krets aktivitet med hjälp av designer receptor exklusivt aktiveras av designer drugs (DREADDs) teknik som reglerar NSCs och nyfödda avkomman i gnagare. Detta omfattande protokoll innehåller stereotaxic injektion av virala partiklar, chemogenetisk stimulering av specifika neurala kretsar, tymidin analog administration, vävnad bearbetning, immunofluorescensmärkning, konfokal avbildning, och Imaging analys av olika stadier av neurala prekursorceller. Detta protokoll innehåller detaljerade instruktioner om antigen hämtnings tekniker som används för att visualisera NSCs och deras avkomma och beskriver ett enkelt men effektivt sätt att modulera hjärnkretsar med hjälp av klozapin N-oxid (CNO) eller CNO-innehållande dricksvatten och DREADDs-uttrycker virus. Styrkan i detta protokoll ligger i dess anpassningsförmåga att studera en mängd olika neurala kretsar som påverkar vuxna neurogenes härrör från NSCs.
Introduction
Adult neurogenes är en biologisk process genom vilken nya nervceller föds i en vuxen och integreras i de befintliga neurala nätverken1. Hos människor sker denna process i dentate gyrus (DG) i hippocampus, där omkring 1 400 nya celler föds varje dag2. Dessa celler bor i den inre delen av DG, som hamnar en neurogen nisch, kallas subgranulat zon (SGZ). Här, Hippocampus vuxna neurala stamceller (NSCs) genomgår en komplicerad utvecklingsprocess för att bli fullt fungerande nervceller som bidrar till regleringen av specifika hjärnfunktioner, inklusive inlärning och minne, humör reglering, och stress Response3 ,4,5,6. För att påverka beteenden regleras vuxna NSCs starkt av olika yttre stimuli på ett aktivitetsberoende sätt genom att reagera på en rad lokala och distala kemiska signaler. Dessa kemiska ledtrådar inkluderar signalsubstanser och Neuromodulatorer och agera i en krets specifikt sätt från olika hjärnregioner. Viktigt, krets bred konvergens av dessa kemiska ledtrådar på NSCs möjliggör unik och exakt reglering av stamcells aktivering, differentiering, och öde beslut.
Ett av de mest effektiva sätten att förhöra krets reglering av vuxna NSCs in vivo är genom att para ihop immunofluorescensanalys med krets wide manipulationer. Immunofluorescensanalys av vuxna NSCs är en vanligt utnyttjad teknik, där antikroppar mot specifika molekylära markörer används för att indikera utvecklingsstadiet av vuxna NSCs. Dessa markörer inkluderar: nestin som en radiell glia cell och tidig neurala progenitorceller markör, Tbr2 som en mellanliggande progenitorceller markör, och DCX som en neuroblast och omogen neuron markör7. Dessutom, genom att administrera tymidinanaloger såsom BrdU, cidu, IDU, och edu, kan cellpopulationer som genomgår S-fasen vara individuellt märkta och visualiserade8,9,10. Genom att kombinera dessa två metoder, ett brett spektrum av frågor kan undersökas allt från hur spridningen regleras vid specifika utvecklingsstadier, hur olika signaler påverkar NSC differentiering och neurogenes.
Flera alternativ finns för att effektivt manipulera neurala kretsar inklusive elektrisk stimulering, optogenetik, och chemogenetics, var och en med sina egna fördelar och nackdelar. Elektrisk stimulering innebär en omfattande kirurgi där elektroder implanteras till en specifik hjärnregion som senare används för att överföra elektriska signaler för att modulera en riktad hjärnregion. Men detta tillvägagångssätt saknar både cellulära och krets specificitet. Optogenetik innebär leverans av virala partiklar som kodar en ljus aktiverad receptor som stimuleras av en laser som avges genom en implanterad optisk fiber, men kräver omfattande manipulationer, stora kostnader, och komplexa operationer11. Chemogenetics innebär leverans av virala partiklar som kodar en designer receptor uteslutande aktiveras av designer droger eller DREADDs, som därefter aktiveras av en specifik och biologiskt inert ligand kallas klozapin N-oxid (CNO)12 . Fördelen med att använda DREADDs för att manipulera lokala neurala kretsar som reglerar vuxna NSCs ligger i lätthet och olika vägar CNO administration. Detta möjliggör en mindre tidskrävande metod med minskad djurhantering, vilket är lätt att anpassa för långtidsstudier för att modulera neurala kretsar.
Den metod som beskrivs i detta protokoll är en omfattande samling av olika protokoll som krävs för att framgångsrikt förhöra krets reglering av vuxna Hippocampus neurogenes som kombinerar både immunofluorescensteknik och krets manipulationer använda chemogenetics. Den metod som beskrivs i följande protokoll är lämplig för att stimulera eller hämma en eller flera kretsar samtidigt in vivo för att bestämma deras reglerande funktion på Adult neurogenes. Denna metod används bäst om frågan inte behöver en hög grad av tidsmässig upplösning. Frågor som kräver exakt temporala kontroll av stimulering/hämning vid en viss frekvens, kan bättre åtgärdas med optogenetik13,14. Den metod som beskrivs här är lätt anpassad för långtidsstudier med minimal djurhantering, särskilt där stress är ett stort problem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Målet med detta protokoll är att bedöma hur manipulera specifika neurala kretsar reglerar vuxna Hippocampus neurogenes in vivo med hjälp av en serie av immunohistokemi tekniker. Assaying aktivitet beroende reglering av vuxna neurogenes medieras av specifika neurala kretsar är en värdefull teknik med stor potential för ändringar att studera ett varierat utbud av neurala kretsar. Framgången för dessa typer av experiment beror på flera faktorer, inklusive korrekt viral leverans, ordentlig viral val för önskad m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
L.J.Q. stöddes av National Institute of Mental Health i National Institutes of Health under mångfalds tillägg R01MH111773 samt ett T32 utbildningsbidrag T32NS007431-20. Detta projekt stöddes från bidrag som tilldelades JS från NIH (MH111773, AG058160, och NS104530).
Materials
| 24 Well Plate | Thermo Fisher Scientific | 07-200-84 | |
| 48 Well Plate | Denville Scientific | T1049 | |
| 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine (Edu) | Carbosynth | NE08701 | |
| Alcohol 70% Isopropyl | Thermo Fisher Scientific | 64-17-5 | |
| Alcohol Prep Pads | Thermo Fisher Scientific | 13-680-63 | |
| Alexa-488 Azide | Thermo Fisher Scientific | A10266 | |
| Anti-Chicken Nestin | Aves | NES; RRID: AB_2314882 | |
| Anti-Goat DCX | Santa Cruz | Cat# SC_8066; RRID: AB_2088494 | |
| Anti-Mouse Tbr2 | Thermo Fisher Scientific | 14-4875-82; RRID: AB_11042577 | |
| Betadine Solution (povidone-iodine) | Amazon | ||
| Citiric Acid Stock [.1M] Citric Acid (21g/L citric acid) | Sigma-Aldrich | 251275 | |
| Clozapine N- Oxide | Sigma-Aldrich | C08352-5MG | |
| Confocal Software (Zen Black) | Zeiss Microscopy | Zen 2.3 SP1 FP1 (black) | |
| Copper (II) Sulfate Pentahydrate | Thermo Fisher Scientific | AC197722500 | |
| Cotton Swabs | Amazon | ||
| Coverslip | Denville Scientific | M1100-02 | |
| Delicate Task Wipe Kimwipes | Kimtech Science | 7557 | |
| Drill Bit .5mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Ethylene Glycol | Thermo Fisher Scientific | E178-1 | |
| Hamilton Needle 2 inch | Hmailton Company | 7803-05 | |
| Hamilton Syringe 5uL Model 75 RN | Hmailton Company | Ref: 87931 | |
| High Speed Drill | Foredom | 1474 | |
| Infusion Pump | Harvard Apparatus | 70-4511 | |
| Injectable Saline Solution | Mountainside Health Care | NDC 0409-4888-20 | |
| Insulin Syringe | BD Ultra-Fine Insulin Syringes | ||
| Isoflurane | Henry Schein | 29405 | |
| Stereotax For Small Animal | KOPF Instruments | Model 942 | |
| Leica M80 | Leica | ||
| Leica Microtome | Leica | SM2010 R | |
| LSM 780 | Zeiss Microscopy | ||
| Nair (Hair Removal Product) | Nair | ||
| Paraformaldahyde 4% | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Plus Charged Slide | Denville Scientific | M1021 | |
| Phosphate Buffered Solution (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010031 | |
| Puralube Vet Ointment | Puralube | ||
| Slide Rack 20 slide unit | Electron Microscopy Science | 70312-24 | |
| Slide Rack holder | Electron Microscopy Science | 70312-25 | |
| Small Animal Heating Pad | K&H | ||
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Super PAP Pen 4 mm tip | PolySciences | 24230 | |
| Surgical Scalpel | MedPride | 47121 | |
| Tris Buffered Solution (TBS) | Sigma-Aldrich | T5912 | |
| Tri-sodium citrate Stock [.1M] Tri-sodium Citrate (29.4g/L tri-sodium citrate) | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 93443 | |
| Tweezers | Amazon | ||
| Vet Bond Tissue Adhesive | 3M | 1469SB |
References
- Zhao, C., Deng, W., Gage, F. H. Mechanisms and Functional Implications of Adult Neurogenesis. Cell. 132 (4), 645-660 (2008).
- Spalding, K. L., et al. Dynamics of hippocampal neurogenesis in adult humans. Cell. 153 (6), 1219-1227 (2013).
- Hill, A. S., Sahay, A., Hen, R. Increasing Adult Hippocampal Neurogenesis is Sufficient to Reduce Anxiety and Depression-Like Behaviors. Neuropsychopharmacology. 40 (10), 2368-2378 (2015).
- Clelland, C. D., et al. A functional role for adult hippocampal neurogenesis in spatial pattern separation. Science. 325, (2009).
- Sahay, A., et al. Increasing adult hippocampal neurogenesis is sufficient to improve pattern separation. Nature. 472 (7344), 466-470 (2011).
- Anacker, C., et al. Hippocampal neurogenesis confers stress resilience by inhibiting the ventral dentate gyrus. Nature. , 1 (2018).
- Kuhn, H. G., Eisch, A. J., Spalding, K., Peterson, D. A. Detection and Phenotypic Characterization of Adult Neurogenesis. Cold Spring Harb Perspect Biol. , (2016).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), 1-13 (2015).
- Podgorny, O., Peunova, N., Park, J. H., Enikolopov, G. Triple S-Phase Labeling of Dividing Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 615-626 (2018).
- Taupin, P. BrdU immunohistochemistry for studying adult neurogenesis: Paradigms, pitfalls, limitations, and validation. Brain Research Reviews. 53 (1), 198-214 (2007).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Armbruster, B. N., Li, X., Pausch, M. H., Herlitze, S., Roth, B. L. Evolving the lock to fit the key to create a family of G protein-coupled receptors potently activated by an inert ligand. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (12), 5163-5168 (2007).
- Sidor, M. M., Davidson, T. J., Tye, K. M., Warden, M. R., Diesseroth, K., Mcclung, C. A. In vivo Optogenetic Stimulation of the Rodent Central Nervous System. J Vis Exp. , (2015).
- Yizhar, O., Fenno, L. E., Davidson, T. J., Mogri, M., Deisseroth, K. Primer Optogenetics in Neural Systems. Neuron. 71 (1), 9-34 (2011).
- Yeh, C., Asrican, B., Moss, J., Lu, W., Toni, N., Song, J. Mossy Cells Control Adult Neural Stem Cell Quiescence and Maintenance through a Dynamic Balance between Direct and Indirect Pathways. Neuron. , 1-18 (2018).
- Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable Stereotaxic Surgery in Rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), 20-22 (2008).
- Roth, B. L. Primer DREADDs for Neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Zeng, C., et al. Evaluation of 5-ethynyl-2 ′ -deoxyuridine staining as a sensitive and reliable method for studying cell proliferation in the adult nervous system. Brain Research. 1319, 21-32 (2010).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole Animal Perfusion Fixation for Rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), 1-9 (2012).
- Hussaini, S. M. Q., Jun, H., Cho, C. H., Kim, H. J., Kim, W. R., Jang, M. Heat-induced antigen retrieval: an effective method to detect and identify progenitor cell types during adult hippocampal neurogenesis. J Vis Exp. , (2013).
- West, M. J., Slomianka, L., Gundersen, H. J. G. Unbiased stereological estimation of the total number of neurons in the subdivisions of the rat hippocampus using the optical fractionator. The Anatomical Record. 231 (4), 482-497 (1991).
- Kuhn, H., Dickinson-Anson, H., Gage, F. Neurogenesis in the dentate gyrus of the adult rat: age-related decrease of neuronal progenitor proliferation. The Journal of Neuroscience. 16 (6), 2027-2033 (1996).
- Gomez, J. L., et al. Chemogenetics revealed: DREADD occupancy and activation via converted clozapine. Science. 357 (6350), 503-507 (2017).
- Thompson, K. J., et al. Dreadd Agonist 21 (C21) Is an Effective Agonist for Muscarnic-Based Dreadds in Vitro and in Vivo. ACS Pharmacology & Translational Science. 72 (3), (2018).
