Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle
Summary
Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.
Abstract
Die Verwendung von HiPSC abgeleitete Zellen stellt einen wertvollen Ansatz zur menschlichen neurodegenerativen Krankheiten zu studieren. Hier beschreiben wir ein optimiertes Protokoll für die Differenzierung von HiPSCs abgeleitet von einem Patienten mit der Parkinson-Krankheit (PD) die Verdreifachung der Alpha-Synuclein Gens (SNCA) Locus-relevanten dopaminergen neuronalen Populationen. Beweise sammeln hat gezeigt, dass hohe Konzentrationen von SNCA ursächlich für die Entwicklung der PD erkennen die ungedeckten neue therapeutische Ansätze für PD, vor allem die Ausrichtung auf die Regulierung der SNCA Ausdruck, schaffen müssen wir vor kurzem entwickelt ein CRISPR/dCas9-DNA-Methylierung-basiertes System zur epigenetisch modulieren SNCA Transkription durch Methylierung Ebenen auf der SNCA Intron 1 regulatorischen Region zu bereichern. Das System, bestehend aus einem Toten liefern (deaktiviert) Version des Cas9 (dCas9) fusioniert mit der katalytischen Domäne des DNA-Methyltransferase Enzym 3A (DNMT3A), Lentivirale Vektor verwendet. Dieses System gilt für Zellen mit der Verdreifachung der SNCA -Locus und reduziert die SNCA-mRNA und Protein-Spiegel um ca. 30 % durch die gezielte DNA-Methylierung der SNCA Intron 1. Die fein abgestimmte Herabregulation der SNCA Ebenen rettet krankheitsbezogenen zelluläre Phänotypen. Das aktuelle Protokoll wollen wir eine schrittweise Anleitung zur Differenzierung von HiPSCs in neurale Vorläuferzellen (NPCs) und die Etablierung und Validierung von Pyrosequenzierung Assays für die Auswertung des Profils Methylierung in der SNCA beschreiben Intron 1. Um im Detail die Lentivirus-CRISPR/dCas9-System in diesen Experimenten verwendeten umreißen, beschreibt dieses Protokoll zu produzieren, zu reinigen und Lentivirale Vektoren zu konzentrieren und ihre Eignung für Epigenom und Genom-Bearbeitung Anwendungen mit hervorheben HiPSCs und NPCs. Das Protokoll ist leicht anpassbar und kann verwendet werden, um hohe Titer Lentiviren für in-vitro- und in-vivo Anwendungen zu produzieren.
Introduction
Mehreren Epigenom-editing-Plattformen wurden vor kurzem entwickelt, um jede DNA-Sequenzen in den Regionen abzielen, die gen-Expression-1,–2zu kontrollieren. Die erstellten Epigenom-editing-Tools sollen (i) Transkription regulieren, (Ii) Änderungen posttranslationale Histon-Modifikationen, (Iii) ändern DNA-Methylierung und (iv) modulieren regulatorisches Element Interaktionen. Der Ansatz, die Transkription/Chromatin-Modifizierer auf eine deaktivierte (tot) Cas9 zu verankern (dCas9) von zuvor entwickelten Epigenom-editing-Plattformen, z. B. Zink angehoben finger Proteine (ZFPs) und Transkription Aktivator-ähnlichen Effektoren (Geschichten) beherbergen eine potente transkriptionelle Effektor-Domäne verschmolzen (ED) mit der gestalteten DNA-bindende Domäne (DBD)3. Die Ergebnisse der gewünschten Phänotyp wie Aktivierung oder Unterdrückung zeichnet sich durch die Effektor-Molekül an der endogenen Loci (Abbildung 1) verankert. Um programmierbare transcriptional Aktivatoren zu erstellen, sind dCas9/gRNA Module mit VP164,5,6 (Abbildung 1A), einer viralen Aktivierungsdomäne verknüpft, die Pol-II und die allgemeine Transkriptionsmaschinerie rekrutiert. Die Änderung dieses Systems hat VP64, ein Tetramer VP16 Domains, bietet eine noch robustere Aktivierung Rate5,6enthalten. Das System wurde erfolgreich eingesetzt, um Codierung und nichtkodierende Regionen zu aktivieren, indem Sie auf Förderer und regulatorischen Elemente. Wichtig ist, auch wenn VP64 Moleküle der Chromatinstruktur in der Zielregion nicht direkt ändern, es Rekruten Chromatin-Modifikatoren, die Ergebnisse im Ablagerung der aktiven (Euchromatin) Marken, unter anderem als H3/H4 Acetylierung und H3-K4 di binden / Tri-Methylierung5,6. Neben VP64 hat der p65-Untereinheit des menschlichen NF-κB-Komplexes zur dCas9/gRNA Modul7angebunden worden. Interessanterweise führt die Anbindehaltung von diese Effektoren für die Regionen stromaufwärts der Transkription Start Seiten (TSK) und innerhalb von Promotoren einen starken gen Induktion. Dennoch können VP64 und p65 Effektoren auch die activatory Wirkungen ausüben, während der Verbindung mit den Regionen flussabwärts von TSK und am distalen Geschmacksverstärker7,8. Eine robustere transcriptional Antwort zu entlocken, müssen mehrere dCas9-VP64 oder dCas9-p65 Fusionen in ein einzelnes Ziel Locus9,10eingestellt werden. So führte die jüngste Entwicklung der nächsten Generation Aktivatoren, die mehrere Effektor Domains durch einen einzigen dCas9-gRNA Komplex, wie SunTag, rekrutieren eine stärkere Aktivierung Fähigkeit im Vergleich zu dCas9-VP64 Fusion Kollegen11 , 12. eine verbesserte transkriptionelle Aktivierung erzielt wurde, durch die Verschmelzung von VP64, p65 und Rta (VPR), einer Domäne werden von Gamma-Herpesviren an den C-Terminus des dCas913 (Abb. 1A). Ähnliche CRISPR/dCas9-Systeme wurden für Target-spezifische Unterdrückung (Abbildung 1 b) entwickelt.
Endogenen gen Unterdrückung kann mit veränderter Repressor Fusionen durch eine Vielzahl von Mechanismen (Abbildung 1 b) erreicht werden. Es hat sich gezeigt, dass CRISPR/dCas9 Systeme, verbunden mit der Repressor DBD (auch ohne ein Effektor-Domäne/s), effizient Genexpression während angebunden, um einen Promotor oder upstream/downstream-TSS Regionen3,6 Schweigen kann ,14. Die Auswirkungen auf die Transkription wird durch die sterische Einmischung der Transkription Faktor Bindung und RNA-Polymerase Verarbeitung verursacht. Dennoch sind umfassendere Ansätze notwendig, da gen Unterdrückung durch sterische Behinderung allein oft nicht ausreicht für robuste zum Schweigen zu bringen. Die jüngste Entwicklung der nächsten Generation von Schalldämpfern auf Basis CRISPR/dCas9 Systeme tragen transkriptioneller Repressor Domänen (TRDs), Histon Modifikatoren (H3-K9 – di / Tri-Methylierung, H3-K27 di-/ Tri-Methylierung; H3-K36 di-/ Tri-Methylierung, H3/H4 Deacetylation), und führte zum Bau von epigenetischen Tools ermöglicht stabilere Effekte4,5,15,16, zum Schweigen zu bringen (CpG) DNA-Methylierung 17,18,19,20. Es wurde nachgewiesen, dass die Rekrutierung von diese epigenetischen Modifikatoren der DNA führen zur Bildung von mehr geschlossen und verkürzte Chromatin, die in der Regel ein potenter Stummschaltungs-Ergebnis21,22erzeugen. Die am häufigsten Stummschaltungs-Domäne mit DBDs verwendet ist der Krüppel-assoziierten Box (Krabbe)4,5. Die Einstellung des Faktors nachgewiesen Chromatin Änderungen entsprechen; Allerdings sind die Mechanismen dieser Modifikationen noch aufgeklärt16,17,18sein. Vor kurzem hat sich gezeigt, dass die Lokalisierung von KRAB DNA die Montage von Histon-Methyltransferase SETDB1 und die Histon Deacetylation (HDAC) NuRD-komplexe fördern kann, die Möglichkeit, die diese Interaktionen die Bildung von vermitteln Chromatin-Kondensation und transcriptional silencing3,13. Als ein alternativer Ansatz können Effektor Domänen, DBDs, erstellen Sie eine benutzerdefinierte epigenetische silencing Protein fusioniert werden. Dieses System katalysiert direkt repressive DNA-Spuren oder Histon-Modifikationen.
Vor kurzem hat die Verwendung von synthetischen CRISPR/dCas9-Systeme angebunden an das Enzym DNMT3A transkriptionelle Deaktivierung zweckentfremdet worden. DNMT3A katalysiert DNA-Methylierung, die transkriptionelle Repression während der Bildung von Heterochromatin auf endogene gen Promotoren und anderen regulatorischen Regionen (Abbildung 1 b)18,20ausübt. McDonald Et Al.18 und Vojta Et Al.20 waren die ersten Autoren berichten, dass DNA-Methylierung verwendet werden kann, für Epigenom-Gen-silencing oder Unterdrückung, nachzuweisen, dass das Plasmid geliefert dCas9-DNMT3A-Fusion-System potent verbessern können Cytosin Methylierung um die TSS-18,–20. McDonald und Kollegen gezeigt, dass die Beschäftigung der Strategie von einer signifikanten Reduktion (ca. 40 %) führen kann in einem Tumor-Suppressor-gen Level CDKN2A mRNA18. Ebenso zeigt das unmethylated Promotorregion BACH oder IL6ST Gene targeting erhöhter CpG Methylierung, die mit einem doppelten Rückgang der gen-Expression-20korreliert worden. Unser Labor hat vor kurzem die Verwendung von DNA-Methylierung für die pathologischen Ergebnisse der SNCA Überexpression (Abbildung 2)23mildernde umgewidmet. Die Strategie basiert auf selektiven Verstärkung in der DNA-Methylierung in der SNCA Intron 1 Region, wie es bereits berichtet wurde, zu hypomethyliert bei Morbus Parkinson und Demenz mit Lewy Körpern (DLB) Gehirn24,25, 26. Diese Hypomethylierung ist mit SNCA Überexpression, bietet somit ein attraktives Ziel für therapeutische Intervention24,27,28verbunden worden. Wir zeigten kürzlich einem niedrigen Niveau der DNA-Methylierung in der SNCA Intron 1 Region in HiPSC abgeleitet dopaminergen NPCs aus einem PD-Patienten mit der SNCA Verdreifachung23gewonnen. Der Vorteil dieser experimentellen Modells ist, dass die NPCs können robust in Kultur vermehrt oder weiter in Reife Neuronen ermöglichen eine effiziente Sortierung differenziert, genetische Faktoren zu identifizieren, die zelluläre Phänotypen, einschließlich oxidativen vermitteln Stress und Apoptose29. Darüber hinaus ermöglicht dieses Modellsystem Wissenschaftler, die entwicklungspolitische Ereignisse zu rekapitulieren, die vor dem Einsetzen der Symptome bei Patienten aufgetreten sind. Darüber hinaus vertreten HiPSC abgeleitet NPCs ein großartiges Werkzeug, um die zellulären und molekularen Wege zugeordnete Genexpression zu testen. Wichtig ist, können HiPSC abgeleitet NPCs in Kombination mit State-of-the-Art CRISPR/Cas9-Epigenom Technologie die Entwicklung der “Next-Generation-Drogen” für viele Neurodegenerative Erkrankungen erheblich erleichtern.
Um pathologische Verringerung der SNCA Ausdruck wir kürzlich entwickelt, ein Lentivirus basierendes System mit einem dCas9-DNMT3A Schmelzverfahren Protein und gRNA, speziell Ziel CpG Methylierung innerhalb der SNCA Intron 1 (Abbildung 2A)23. Dieses Protokoll wird Lentivirale Vektor (LV)-Design und Produktion im Detail beschreiben. LVs repräsentieren ein wirksames Mittel zur Bereitstellung von CRISPR/dCas9 Komponenten aus mehreren Gründen, nämlich (i) ihre Fähigkeit, sperrige DNA tragen einfügt, (Ii) einen hohen Wirkungsgrad von transducing eine Vielzahl von Zellen, einschließlich der trennende und nondividing Zellen30 , und (Iii) ihre Fähigkeit, minimale zytotoxische und immunogenen Reaktionen auslösen. Vor kurzem, wir das LV-System auf HiPSC abgeleitet dopaminergen Neuronen eines Patienten mit der Verdreifachung der SNCA Locus angewendet und demonstriert das therapeutische Potenzial von LVs für die Lieferung der Epigenom-Bearbeitung Methylierung Werkzeuge23 ( Abbildung 2 b). In der Tat bewirkt, dass eine LV-gRNA/dCas9-DNMT3A System eine deutliche Steigerung in der DNA-Methylierung bei der SNCA Intron 1 Region. Diese Erhöhung entspricht die Reduktion in der Höhe der SNCA mRNA und Protein23. Außerdem rettet SNCA Herabregulation PD-bezogene Phänotypen in der SNCA Verdreifachung/HiPSC-abgeleitete dopaminergen Neuronen (z. B. mitochondrialen ROS Produktion und Zelle Tragfähigkeit)23. Wichtig ist, haben wir bewiesen, dass der Rückgang der SNCA Ausdruck vom LV-gRNA-dCas9-DMNT3A-System ist in der Lage, die Umkehrung der Phänotypen, die charakteristisch sind für HiPSC abgeleitet dopaminergen Neuronen von einem PD-Patienten, die die durchgeführt SNCA Verdreifachung, z. B. mitochondrialen ROS Produktion und Zelle Lebensfähigkeit23. Das Ziel dieses Protokolls ist (1) das Protokoll der Produktion und Konzentration einer optimierten LV-Plattform für die Erzeugung von qualitativ tittered virale Vorbereitungen zu skizzieren und (2) die Differenzierung des HiPSCs in NPCs zu Reifen dopaminergen gemustert zu beschreiben Neuronen31,32 und die Charakterisierung der Methylierung Ebenen der gezielten Region innerhalb SNCA Intron 1.
Lentivirale Plattformen haben einen großen Vorteil über die beliebteste Plattform der Vektor, nämlich Adeno-assoziierten Vektoren (Flugabwehrpanzer), die das ehemalige Fähigkeit, größere genetische Einsätze33,34unterzubringen ist. Flugabwehrpanzer auf deutlich höhere Erträge generiert werden können, sondern besitzen eine niedrige Verpackungsleistung (< 4,8 kb), gefährden ihre Verwendung für die Bereitstellung von all-in-One CRISPR/Cas9 Systeme. So scheint es, dass die LVs die Plattform der Wahl in den Anwendungen an der Lieferung beteiligten CRISPR/dCas9 Werkzeuge wäre. Daher werden die hier beschriebene Protokoll ein wertvolles Werkzeug für die Forscher in dem Wunsch, effektiv Epigenom-Bearbeiten von Komponenten zu den Zellen und Organen liefern. Das Protokoll weiter skizziert die Strategie, um die Produktion und Ausdruck der Vektoren über eine Änderung in der GUS der Elemente innerhalb der Vektor Ausdruck Kassette30,35zu verbessern. Die Strategie basiert auf dem Roman System entwickelt und in unserem Labor untersucht und zeigt seine Fähigkeit auf virale Partikel im Bereich von 1010 virale Einheiten (VU) /mL30,35zu produzieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
LVs haben damit begonnen, als das Fahrzeug der Wahl für das Epigenom bearbeiten, vor allem im Zusammenhang mit genetischen Erkrankungen entstehen, vor allem wegen ihrer Fähigkeit, (i) Platz für große DNA-Nutzlasten und (Ii) effizient transduzieren eine Vielzahl von Teilen und nondividing Zellen. Die große Verpackung Wirksamkeit der LVs ist besonders vorteilhaft für die Anwendungen, bei denen Verpackung der CRISPR/dCas9-Systeme, die übergroß sind. Aus dieser Perspektive stellen LVs die Plattform der Wahl für die …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde teilweise von den Kahn Neurotechnologie Development Award (für OC) und die nationalen Institute der Gesundheit/National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall (NIH/NINDS) finanziert (R01 NS085011, OC).
Materials
| Equipment | |||
| Optima XPN-80 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | A99839 | |
| 0.22 μM filter unit, 1L | Corning | 430513 | |
| 0.45-μm filter unit, 500mL | Corning | 430773 | |
| 100mm TC-Treated Culture Dish | Corning | 430167 | |
| 15 mL conical centrifuge tubes | Corning | 430791 | |
| 150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid | Corning | 353025 | |
| 50mL conical centrifuge tubes | Corning | 430291 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Aggrewell 800 | StemCell Technologies | 34811 | |
| Allegra 25R tabletop centrifuge | Beckman Coulter | 369434 | |
| BD FACS | Becton Dickinson | 338960 | |
| Conical bottom ultracentrifugation tubes | Seton Scientific | 5067 | |
| Conical tube adapters | Seton Scientific | PN 4230 | |
| Eppendorf Cell Imaging Slides | Eppendorf | 30742060 | |
| High-binding 96-well plates | Corning | 3366 | |
| Inverted fluorescence microscope | Leica | DM IRB2 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (50) | Qiagen | 27104 | |
| Reversible Strainer | StemCell Technologies | 27215 | |
| SW32Ti rotor | Beckman Coulter | 369650 | |
| VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic | VWR | 93000-694 | |
| VWR® Vacuum Filtration Systems | VWR | 89220-694 | |
| xMark™ Microplate Absorbance plate reader | Bio-Rad | 1681150 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cell culture reagents | |||
| Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells | ATCC | CRL-3216 | |
| Accutase | StemCell Technologies | 7920 | |
| Anti-Adherence Rinsing Solution | StemCell Technologies | 7010 | |
| Anti-FOXA2 Antibody | Abcam | Ab60721 | |
| Anti-Nestin Antibody | Abcam | Ab18102 | |
| Antibiotic-antimycotic solution, 100X | Sigma Aldrich | A5955-100ML | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Thermo Fisher Scientific | 12587010 | |
| BES | Sigma Aldrich | B9879 – BES | |
| Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) | Thermo Fisher Scientific | 15260037 | |
| CHIR99021 | StemCell Technologies | 72052 | |
| Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | 08-774-552 | |
| Cosmic Calf Serum | Hyclone | SH30087.04 | |
| DMEM-F12 | Lonza | 12-719 | |
| DMEM, high glucose media | Gibco | 11965 | |
| DNeasy Blood & Tissue Kit | Qiagen | 69504 | |
| EpiTect PCR Control DNA Set | Qiagen | 596945 | |
| EZ DNA Methylation Kit | Zymo Research | D5001 | |
| Gelatin | Sigma Aldrich | G1800-100G | |
| Gentamicin | Thermo Fisher Scientific | 15750078 | |
| Gentle Cell Dissociation Reagent | stemCell Technologies | 7174 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
| Human Recombinant bFGF | StemCell Technologies | 78003 | |
| Human Recombinant EGF | StemCell Technologies | 78006 | |
| Human Recombinant Shh (C24II) | StemCell Technologies | 78065 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | |
| mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502001 | |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | |
| Non-Essential Amino Acid (NEAA) | Hyclone | SH30087.04 | |
| PyroMark PCR Kit | Qiagen | 978703 | |
| RPMI 1640 media | Thermo Fisher Scientific | 11875-085 | |
| SB431542 | StemCell Technologies | 72232 | |
| Sodium pyruvate | Sigma Aldrich | S8636-100ML | |
| STEMdiff Neural Induction Medium | StemCell Technologies | 5835 | |
| STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium | StemCell Technologies | 5838 | |
| TaqMan Assay FOXA2 | Thermo Fisher Scientific | Hs00232764 | |
| TaqMan Assay GAPDH | Thermo Fisher Scientific | Hs99999905 | |
| TaqMan Assay Nestin | Thermo Fisher Scientific | Hs04187831 | |
| TaqMan Assay OCT4 | Thermo Fisher Scientific | Hs04260367 | |
| TaqMan Assay PPIA | Thermo Fisher Scientific | Hs99999904 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | Gibco | 25300054 | |
| Y27632 | StemCell Technologies | 72302 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| p24 ELISA reagents | |||
| Monoclonal anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | 3537 | |
| Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG | Sigma Aldrich | 12-348 | Working concentration 1:1500 |
| Goat serum, Sterile, 10mL | Sigma | G9023 | Working concentration 1:1000 |
| HIV-1 standards | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP968F | |
| Normal mouse serum, Sterile, 500mL | Equitech-Bio | SM30-0500 | |
| Polyclonal rabbit anti-p24 antibody | NIH AIDS Research and Reference Reagent Program | SP451T | |
| TMB peroxidase substrate | KPL | 5120-0076 | Working concentration 1:10,000 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pMD2.G | Addgene | 12253 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 52961 | |
| psPAX2 | Addgene | 12259 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Restriction enzymes | |||
| BsmBI | New England Biolabs | R0580S | |
| BsrGI | New England Biolabs | R0575S | |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S | |
| KpnI | New England Biolabs | R0142S | |
| PacI | New England Biolabs | R0547S | |
| SphI | New England Biolabs | R0182S |
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