JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Лентивирусные вектор платформа для эффективной доставки Epigenome-инструменты для редактирования в человека индуцированных плюрипотентных стволовых клеток болезни моделей

Published: March 29, 2019
doi:
10.3791/59241
, , , , , , , ,
1Department of Neurology,Duke University Medical Center, 2Center for Genomic and Computational Biology,Duke University Medical Center, 3Viral Vector Core,Duke University Medical Center, 4Division of Gynecologic Oncology, Department of Obstetrics and Gynecology,Duke University Medical Center

Summary

Целевые epigenome ДНК, редактирования представляет собой мощный терапевтический подход. Этот протокол описывает производства, очищения и концентрации все-в-одном лентивирусные векторы, укрывательство трансген ТРИФОСФАТЫ dCas9-DNMT3A для epigenome редактирование приложений в человеческое индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC)-производных нейронов.

Abstract

Использование производных hiPSC клеток представляет собой ценный подход к изучению человека нейродегенеративных заболеваний. Здесь мы описываем оптимизированный протокол для дифференциации hiPSCs, производного от пациента с постулатов Локус гена (SNCA) альфа synuclein в болезнь Паркинсона (PD)-отношение дофаминергической нейрональных популяций. Накопление доказательств показывает, что высокий уровень SNCA каузативных для развития PD. Признавая неудовлетворенных необходимо создать новые терапевтические подходы для PD, особенно направленными на регуляцию экспрессии SNCA , мы недавно разработанных ТРИФОСФАТЫ/dCas9-ДНК Метилировани-на базе системы эпигеномно модулировать транскрипции SNCA , обогащая уровень метилирования в регионе нормативных Интрон 1 SNCA . Чтобы доставить система, состоящая из мертвых (отключен) версия Cas9 (dCas9) сливается с каталитического домен 3A фермента ДНК метилтрансфераза (DNMT3A), используется лентивирусные вектор. Эта система применяется к ячейкам с постулатов Локус SNCA и уменьшает SNCA-мРНК и уровни белка, около 30% через целевые метилирования Интрон SNCA 1. Доработаны Даунрегуляция SNCA уровней спасает сотовой фенотипов, связанных с болезнью. В текущем протоколе мы стремимся описать пошаговую процедуру для дифференциации hiPSCs в нейронных прогениторных клеток (НПС) и создание и проверка пиросеквенирования анализов для оценки профиля метилирования в SNCA Интрон 1. Более подробно изложить человека ТРИФОСФАТЫ/dCas9 система, используемая в этих экспериментах, этот протокол описывает, как производить, очищают и сконцентрировать лентивирусные векторы и подчеркнуть их пригодности для epigenome – и -изменения генома приложений, использующих hiPSCs и НПС. Протокол может быть легко адаптирована и могут быть использованы для производства высокого титра lentiviruses для приложений в vitro и in vivo.

Introduction

Epigenome редактирования платформ недавно была разработана для любых последовательностей ДНК в регионах, которые контролируют ген выражение1,2. Созданные инструменты редактирования epigenome предназначены для (i) регулируют транскрипцию, (ii) изменять Посттрансляционная гистона модификации, (iii) изменения метилирования и (iv) модулировать регуляторные элементы взаимодействия. Подход к якорь транскрипция/хроматина модификаторы списанного (мертвый) Cas9 (dCas9) поднял из ранее развитых epigenome редактирования платформ, таких как цинк палец белки (ZFPs) и транскрипции активатор как эффекторов (сказки), укрывательство мощным transcriptional эффекторных домен (Эд) сливается с дизайном ДНК связывающий домен (DBD)3. Результаты желаемого фенотип, такие как активация или репрессий определяется эффекторные молекулы, привязанный к эндогенной локусов (рис. 1). Для создания программируемой transcriptional активаторы, dCas9/gRNA модули связаны с VP164,5,6 (рис. 1а), вирусные активации домена, новобранцев Pol II и механизмы общего транскрипции. Модификации этой системы включает VP64, Тетрамер VP16 доменов, обеспечивая еще более надежной активации ставка5,6. Система успешно работает для того чтобы активировать кодирования и некодирующей регионов путем промоутеров и нормативных элементов. Важно отметить, что даже несмотря на то, что VP64 молекулы изменить структуру хроматина в целевом регионе непосредственно, он новобранцев хроматина модификаторы, которые связывают результаты осаждения активный (euchromatin) знаков, включая как H3/H4 ацетилирования и H3-K4 di / Tri метилирования5,6. В дополнение к VP64 субъединица p65 человека NF-κB комплекса были привязаны к dCas9/gRNA модуль7. Интересно привязывая Эти эффекторы в регионы вверх по течению транскрипции начала сайтов (тссс) и в пределах промоутеров приводит к сильным гена индукции. Тем не менее VP64 и p65 эффекторов можно также оказывают activatory эффекты во время связаны с регионов, расположенных ниже по течению, ТССС и дистальной усилители7,8. Для получения более надежной транскрипционный анализ ответа, несколько dCas9-VP64 или dCas9-p65 сплавливания нужно набираться для одной цели Локус9,10. Таким образом недавнее развитие активаторы следующего поколения, которые набору несколько доменов эффекторных одного dCas9-gRNA комплексом, таких как SunTag, привело к сильной активации возможности по сравнению с dCas9-VP64 фьюжн партнерам11 , 12. Улучшение transcriptional активации были получены через слияние VP64, Р65 и Rta (VPR), transactivation домена от гамма Герпесвирусы, C-конечная dCas913 (рис. 1A). Подобные системы ТРИФОСФАТЫ/dCas9 были разработаны для конкретных целевых объектов репрессий (рис. 1B).

Эндогенные гена репрессий с инженерии репрессор сплавливания можно добиться различных механизмов (рис. 1B). Было продемонстрировано, что ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем, связанных с репрессор DBD (даже без домена эффекторных/s), можно эффективно замолчать экспрессии генов в то время как привязанный к промоутер или вверх/вниз по течению TSS регионы3,6 ,14. Влияние на транскрипции обусловлено их пространственной помех привязки фактор транскрипции и обработки РНК-полимеразы. Тем не менее необходимы более всеобъемлющие подходы, как ген репрессии их пространственной помех только часто не достаточно для надежной глушителей. Последние разработки следующего поколения глушители на основе ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем перевозящих transcriptional репрессор домены (TRDs), модификаторы гистонов (H3-K9 ди-/ tri метилирования, H3-K27 ди-/ tri метилирования; H3-K36 ди-/ tri метилирования, H3/H4 диацетилморфина) и привело к строительству эпигеномные инструментов, позволяя более надежной, глушителей эффекты4,5,,1516, метилирование ДНК (CpG) 17,18,19,20. Было продемонстрировано, что набор эти эпигеномные модификаторов для ДНК может привести к формированию более закрытой и конденсированных хроматина, который обычно генерируют более мощным глушителей исход21,22. Наиболее часто глушителей домен, используется с DBDs — это связанные Krüppel box (краб)4,5. Набор фактора была продемонстрирована в соответствие с изменениями chromatin; Тем не менее механизмы этих изменений еще не должны быть проясненного16,17,18. Недавно было показано, что локализация краб ДНК может содействовать Ассамблея метилтрансфераза гистона SETDB1 и гистонов диацетилморфина (HDAC) NuRD комплексов, предлагая возможность того, что эти взаимодействия посредником формирования конденсацию хроматина и transcriptional глушителей3,13. В качестве альтернативного подхода эффекторные домены можно сливается с DBDs для создания пользовательских эпигеномные глушителей белка. Эта система непосредственно катализирует репрессивных ДНК знаки или изменения гистона.

Недавно использование синтетических ТРИФОСФАТЫ/dCas9 систем, привязанный к DNMT3A фермента был многоцелевых transcriptional дезактивации. DNMT3A катализирует метилирование ДНК, которая оказывает транскрипционный анализ репрессий на протяжении формирования гетерохроматин эндогенного генным стимуляторам и других регулирующих регионов (рис. 1B)18,20. McDonald et al.18 и войта et al.20 были первые авторы сообщить что метилирование ДНК может использоваться для epigenome-генов или репрессий, демонстрируя, что доставлено плазмида dCas9-DNMT3A системы фьюжн мощно может повысить метилирование цитозина вокруг18,ТП20. Макдональд и coworkers продемонстрировал, что занятости стратегия может привести к значительному сокращению (около 40%) в опухоль супрессирующем Гене CDKN2A мРНК уровнях18. Аналогичным образом ориентация региона unmethylated промоутера генов, Бах или IL6ST показывает увеличение метилирования CpG, что был коррелирует с сокращением вдвое выражение гена20. Наша лаборатория недавно многоцелевых использование метилирование ДНК для ослабления патологических результатов SNCA гиперэкспрессия (рис. 2)23. Стратегия основана на избирательное повышение метилирование ДНК в регионе Интрон 1 SNCA , как ранее сообщалось, чтобы быть hypomethylated в PD и деменции с Леви органов (ДЛБ) мозги24,25, 26. Этот hypomethylation связан с SNCA гиперэкспрессия, таким образом предлагая привлекательной мишенью для терапевтического вмешательства24,27,28. Недавно мы показали низкий уровень метилирования ДНК в SNCA Интрон 1 региона в hiPSC производные дофаминергической НИПы, полученную от PD пациента с SNCA постулатов23. Преимуществом этой экспериментальной модели является что NPC может быть надежно распространен в культуре или далее дифференцированной в зрелых нейронов, позволяя эффективный скрининг для выявления генетических факторов, которые посредником сотовой фенотипов, включая окислительного стресс и апоптоз29. Кроме того эта модель система позволяет ученым охарактеризовать развития событий, которые произошли до появления симптомов у больных. Кроме того hiPSC производные НИПы представляют собой прекрасный инструмент для тестирования клеточном и молекулярном пути, связанные с выражением генов. Важно отметить, что hiPSC производные НПС, в сочетании с технологией ТРИФОСФАТЫ/Cas9-epigenome искусство может значительно облегчить развитие «next-generation наркотиков» для многих нейродегенеративных заболеваний.

Чтобы уменьшить патологического уровня SNCA выражение, мы недавно разработали системы, основанной на человека, dCas9-DNMT3A синтез белка и gRNA специально целевой метилирования CpG внутри SNCA Интрон 1 (рисунок 2A)23. Этот протокол будет описывать лентивирусные вектор (LV) проектирование и производство в деталях. LVs являются эффективным средством доставки компонентов ТРИФОСФАТЫ/dCas9 по нескольким причинам, а именно: (i) их способности выполнять громоздкие ДНК вставляет, (ii) высокой эффективности преобразователя широкий спектр клеток, включая клетки деления и nondividing30 и (iii) их способность вызывать минимальное цитотоксических и иммуногенные ответы. Недавно мы обратились LV системы hiPSC производные дофаминергические нейроны от пациента с постулатов Локус SNCA и продемонстрировал терапевтический потенциал LVs для доставки epigenome редактирования метилирования инструменты23 ( Рисунок 2B). Действительно LV-gRNA/dCas9-DNMT3A системы вызывает значительное увеличение метилирование ДНК в регионе Интрон 1 SNCA . Этот рост соответствует снижением уровня мРНК и белка SNCA 23. Кроме того SNCA Даунрегуляция спасает PD-связанных фенотипы в SNCA постулатов/hiPSC производные дофаминергических нейронов (например, митохондриальной ROS производства и клеток жизнеспособности)23. Важно отметить, что мы показали, что сокращение в выражении SNCA LV-gRNA-dCas9-DMNT3A системы способны обратить вспять фенотипов, которые характерны для hiPSC производные дофаминергические нейроны от PD пациента, который нес SNCA постулатов, например митохондриальной ROS производства и клеток жизнеспособности23. Целью настоящего Протокола является 1) чтобы наметить протокол производства и концентрации LV платформу для создания высокой tittered вирусных препаратов и 2) описывают дифференцирование hiPSCs в NPC, рисунком стать зрелой дофаминергической нейроны31,32 и характеристика уровень метилирования целевого региона в рамках SNCA Интрон 1.

Лентивирусные платформы имеют значительное преимущество над самой популярной платформы вектор, а именно аденоассоциированный векторов (AAVs), который является бывший возможность разместить большие генетические вставки33,34. AAVs могут быть собраны в значительно более высокие урожаи, но обладают низким упаковки емкостью (< 4.8 КБ), ущерба для их использования для доставки все-в-одном ТРИФОСФАТЫ/Cas9 систем. Таким образом оно кажется, что рН будет выбор платформы приложений, участвующих в доставке ТРИФОСФАТЫ/dCas9 инструментов. Таким образом протокол, изложенные здесь будет ценным инструментом для исследователей, желающих эффективно передавать epigenome редактирования компонентов клеток и органов. Протокол также излагается стратегия для увеличения производства и выражения возможности векторов через изменения в СНГ элементов в вектор выражения кассеты30,35. Стратегия основана на романе система разработана и учился в нашей лаборатории и подчеркивается его способность производить вирусных частиц в диапазоне 1010 вирусных единиц (VU) / мл30,35.

Protocol

1. системы проектирования и производства вирус Плазмиды проектирование и строительствоПримечание: Строительство вектор LV-gRNA-dCas9-DNMT3A все-в-одном осуществляется с помощью производства- и оптимизированный выражение выражение кассеты, опубликованные Ортинский et…

Representative Results

Проверка производства титры LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro векторов, по сравнению с коллегой GFP наивно Мы исполняли p24gag ELISA для сравнения между физической титры LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro с коллегами GFP/Puro наивными. Представитель результаты, представл…

Discussion

LVs начали появляться как транспортное средство выбора для редактирования epigenome, особенно в контексте генетических заболеваний, главным образом из-за их способности (i) размещения больших нагрузок ДНК и (ii) эффективно передают широкий спектр деления и nondividing клетки. Крупногабаритная тара…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа частично финансируется Кан нейротехнология развития премию (O.C.) и национальных институтов из здравоохранения/Национальный институт от неврологических расстройств и инсульта (NIH/NINDS) (R01 NS085011 для O.C.).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 – BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering. Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).
  2. Gaj, T., Gersbach, C. A., Barbas, C. F. ZFN, TALEN, and CRISPR/Cas-based methods for genome engineering. Trends in Biotechnology. 31 (7), 397-405 (2013).
  3. Thakore, P. I., Black, J. B., Hilton, I. B., Gersbach, C. A. Editing the epigenome: technologies for programmable transcription and epigenetic modulation. Nature Methods. 13 (2), 127-137 (2016).
  4. Gilbert, L. A., et al. CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes. Cell. 154 (2), 442-451 (2013).
  5. Gilbert, L. A., et al. Genome-Scale CRISPR-Mediated Control of Gene Repression and Activation. Cell. 159 (3), 647-661 (2014).
  6. Perez-Pinera, P., et al. RNA-guided gene activation by CRISPR-Cas9-based transcription factors. Nature Methods. 10 (10), 973-976 (2013).
  7. Chavez, A., et al. Highly efficient Cas9-mediated transcriptional programming. Nature Methods. 12 (4), 326-328 (2015).
  8. Horlbeck, M. A., et al. Nucleosomes impede Cas9 access to DNA in vivo and in vitro. eLife. 5, (2016).
  9. Chavez, A., et al. Comparison of Cas9 activators in multiple species. Nature Methods. 13 (7), 563-567 (2016).
  10. Zhou, H., et al. In vivo simultaneous transcriptional activation of multiple genes in the brain using CRISPR-dCas9-activator transgenic mice. Nature Neuroscience. 21 (3), 440-446 (2018).
  11. Tanenbaum, M. E., Gilbert, L. A., Qi, L. S., Weissman, J. S., Vale, R. D. A protein-tagging system for signal amplification in gene expression and fluorescence imaging. Cell. 159 (3), 635-646 (2014).
  12. Konermann, S., et al. Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex. Nature. 517 (7536), 583-588 (2015).
  13. Holtzman, L., Gersbach, C. A. Editing the Epigenome: Reshaping the Genomic Landscape. Annual Review of Genomics and Human Genetics. , (2018).
  14. Perez-Pinera, P., et al. Synergistic and tunable human gene activation by combinations of synthetic transcription factors. Nature Methods. 10 (3), 239-242 (2013).
  15. Thakore, P. I., et al. Highly specific epigenome editing by CRISPR-Cas9 repressors for silencing of distal regulatory elements. Nature Methods. 12 (12), 1143-1149 (2015).
  16. Amabile, A., et al. Inheritable Silencing of Endogenous Genes by Hit-and-Run Targeted Epigenetic Editing. Cell. 167 (1), 219-232 (2016).
  17. Liu, X. S., et al. Editing DNA Methylation in the Mammalian Genome. Cell. 167 (1), 233-247 (2016).
  18. McDonald, J. I., et al. Reprogrammable CRISPR/Cas9-based system for inducing site-specific DNA methylation. Biology Open. 5 (6), 866-874 (2016).
  19. Huang, Y. H., et al. DNA epigenome editing using CRISPR-Cas SunTag-directed DNMT3A. Genome Biology. 18 (1), 176 (2017).
  20. Vojta, A., et al. Repurposing the CRISPR-Cas9 system for targeted DNA methylation. Nucleic Acids Research. 44 (12), 5615-5628 (2016).
  21. Razin, A., Kantor, B. DNA methylation in epigenetic control of gene expression. Progress in Molecular and Subcellular Biology. 38, 151-167 (2005).
  22. Kantor, B., Ma, H., Webster-Cyriaque, J., Monahan, P. E., Kafri, T. Epigenetic activation of unintegrated HIV-1 genomes by gut-associated short chain fatty acids and its implications for HIV infection. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (44), 18786-18791 (2009).
  23. Kantor, B., et al. Downregulation of SNCA Expression by Targeted Editing of DNA Methylation: A Potential Strategy for Precision Therapy in PD. Molecular Therapy. , (2018).
  24. Jowaed, A., Schmitt, I., Kaut, O., Wullner, U. Methylation regulates alpha-synuclein expression and is decreased in Parkinson’s disease patients’ brains. Journal of Neuroscience. 30 (18), 6355-6359 (2010).
  25. Wang, Y., et al. A DNA methyltransferase inhibitor, 5-aza-2′-deoxycytidine, exacerbates neurotoxicity and upregulates Parkinson’s disease-related genes in dopaminergic neurons. CNS Neuroscience & Therapeutics. 19 (3), 183-190 (2013).
  26. Matsumoto, L., et al. CpG demethylation enhances alpha-synuclein expression and affects the pathogenesis of Parkinson’s disease. PLOS One. 5 (11), e15522 (2010).
  27. Desplats, P., et al. Alpha-synuclein sequesters Dnmt1 from the nucleus: a novel mechanism for epigenetic alterations in Lewy body diseases. Journal of Biological Chemistry. 286 (11), 9031-9037 (2011).
  28. Ai, S. X., et al. Hypomethylation of SNCA in blood of patients with sporadic Parkinson’s disease. Journal of the Neurological Sciences. 337 (1-2), 123-128 (2014).
  29. Tagliafierro, L., Chiba-Falek, O. Up-regulation of SNCA gene expression: implications to synucleinopathies. Neurogenetics. 17 (3), 145-157 (2016).
  30. Ortinski, P. I., O’Donovan, B., Dong, X., Kantor, B. Integrase-Deficient Lentiviral Vector as an All-in-One Platform for Highly Efficient CRISPR/Cas9-Mediated Gene Editing. Molecular Therapy – Methods & Clinical Development. 5, 153-164 (2017).
  31. Tagliafierro, L., et al. Genetic analysis of alpha-synuclein 3′ untranslated region and its corresponding microRNAs in relation to Parkinson’s disease compared to dementia with Lewy bodies. Alzheimer’s & Dementia. 13 (11), 1237-1250 (2017).
  32. Tagliafierro, L., Zamora, M. E., Chiba-Falek, O. Multiplication of the SNCA locus exacerbates neuronal nuclear aging. Human Molecular Genetics. , (2018).
  33. Kantor, B., McCown, T., Leone, P., Gray, S. J. Clinical applications involving CNS gene transfer. Advances in Genetics. 87, 71-124 (2014).
  34. Kantor, B., Bailey, R. M., Wimberly, K., Kalburgi, S. N., Gray, S. J. Methods for gene transfer to the central nervous system. Advances in Genetics. 87, 125-197 (2014).
  35. Vijayraghavan, S., Kantor, B. A Protocol for the Production of Integrase-deficient Lentiviral Vectors for CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockout in Dividing Cells. Journal of Visualized Experiments. (130), e56915 (2017).
  36. Bayer, M., et al. A large U3 deletion causes increased in vivo expression from a nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 16 (12), 1968-1976 (2008).
  37. Bassil, C. F., Huang, Z., Murphy, S. K. Bisulfite pyrosequencing. Methods in Molecular Biology. 1049, 95-107 (2013).
  38. Truong, D. J., et al. Development of an intein-mediated split-Cas9 system for gene therapy. Nucleic Acids Research. 43 (13), 6450-6458 (2015).
  39. Nishimasu, H., et al. Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9. Cell. 162 (5), 1113-1126 (2015).
  40. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  41. Van Lint, C., Ghysdael, J., Paras, P., Burny, A., Verdin, E. A transcriptional regulatory element is associated with a nuclease-hypersensitive site in the pol gene of human immunodeficiency virus type 1. Journal of Virology. 68 (4), 2632-2648 (1994).
  42. Van Lint, C., et al. Transcription factor binding sites downstream of the human immunodeficiency virus type 1 transcription start site are important for virus infectivity. Journal of Virology. 71 (8), 6113-6127 (1997).
  43. Goffin, V., et al. Transcription factor binding sites in the pol gene intragenic regulatory region of HIV-1 are important for virus infectivity. Nucleic Acids Research. 33 (13), 4285-4310 (2005).
  44. Kim, Y. S., et al. Artificial zinc finger fusions targeting Sp1-binding sites and the trans-activator-responsive element potently repress transcription and replication of HIV-1. Journal of Biological Chemistry. 280 (22), 21545-21552 (2005).
  45. Kantor, B., et al. Notable reduction in illegitimate integration mediated by a PPT-deleted, nonintegrating lentiviral vector. Molecular Therapy. 19 (3), 547-556 (2011).

Tags

Keywords: Lentiviral VectorEpigenome EditingHuman Induced Pluripotent Stem CellsDisease ModelsCRISPR/CasAlpha-synucleinGene ExpressionGuide RNAMolecular CloningPlasmid ConstructionNeural Progenitor CellsDNA Methyltransferase (DNMT3A)
check_url/59241?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image