Summary

Piattaforma di vettore lentivirale per la consegna efficiente di strumenti di editing Epigenome nelle umane indotte da modelli di malattia derivati da cellule staminali pluripotenti

Published: March 29, 2019
doi:

Summary

Mirati epigenome DNA modifica rappresenta un approccio terapeutico potente. Questo protocollo descrive la produzione, purificazione e concentrazione di vettori lentivirali all-in-one che harboring il transgene CRISPR-dCas9-DNMT3A per applicazioni di modifica epigenome in cellule staminali pluripotenti indotte umane (hiPSC)-derivato di neuroni.

Abstract

L’uso di cellule derivate da hiPSC rappresenta un valido approccio per lo studio di malattie neurodegenerative umane. Qui, descriviamo un protocollo ottimizzato per la differenziazione di hiPSCs derivata da un paziente con la triplicazione del luogo del gene (SNCA) dell’alfa-synuclein nel morbo di Parkinson (PD)-popolazioni neuronali dopaminergici pertinenti. Raccogliendo la prova ha dimostrato che alti livelli di SNCA sono causativi per lo sviluppo del PD. riconoscere l’insoddisfatte necessario stabilire nuovi approcci terapeutici per PD, specialmente quelli targeting per la regolazione dell’espressione di SNCA , abbiamo recentemente ha sviluppato un sistema CRISPR/dCas9-DNA-metilazione-based per epigeneticamente modulano la trascrizione di SNCA arricchendo i livelli di metilazione presso la regione regolatrice di SNCA introne 1. A consegnare il sistema, costituito da un morto (disattivato) versione di Cas9 (dCas9) fuso con il dominio catalitico del 3A enzima DNA metiltransferasi (DNMT3A), viene utilizzato un vettore lentivirale. Questo sistema viene applicato alle celle con la triplicazione del locus SNCA e riduce la SNCA-mRNA e livelli della proteina di circa il 30% attraverso la metilazione del DNA mirato di SNCA introne 1. Il fine-tuned downregulation dei livelli SNCA Salva fenotipi cellulari correlati alla malattia. Il protocollo attuale, ci proponiamo di descrivere una procedura dettagliata per la differenziazione hiPSCs nella cellule progenitrici neurali (NPC) l’istituzione e la convalida di pyrosequencing saggi per la valutazione del profilo di metilazione in SNCA introne 1. Per strutturare in modo più dettagliato il sistema di lentivirus-CRISPR/dCas9 utilizzato in questi esperimenti, questo protocollo descrive come produrre, purificare e concentrare vettori lentivirali e per evidenziare la loro idoneità per applicazioni epigenome – e -editing genomico utilizzando hiPSCs e NPC. Il protocollo è facilmente adattabile e può essere usato per produrre lentivirus di alto titolo per applicazioni in vitro e in vivo.

Introduction

Più piattaforme di editing-epigenome sono stati recentemente sviluppati per indirizzare eventuali sequenze di DNA nelle regioni che controllano l’espressione genica1,2. Gli strumenti di editing epigenome creati sono progettati per (i) regolare la trascrizione, (ii) modificare le modifiche post-traduzionali degli istoni, (iii) modificare la metilazione del DNA e (iv) modulano interazioni elemento regolatore. L’approccio di ancorare i modificatori di trascrizione/cromatina a un Cas9 (morto) disattivato (dCas9) generato da precedentemente sviluppati piattaforme epigenome di editing, come lo zinco dito proteine (ZFPs) e gli effettori di simil-attivatore di trascrizione (racconti), che harboring un dominio effector trascrizionale potente (ED) fuso a progettato dominio legante il DNA (DBD)3. I risultati del fenotipo desiderato come l’attivazione o la repressione è definito dalla molecola effettore ancorata ai loci endogene (Figura 1). Per creare attivatori trascrizionali programmabili, dCas9/gRNA moduli sono collegati a VP164,5,6 (Figura 1A), un dominio di attivazione virale che reclute Pol II ed il macchinario della trascrizione generale. La modifica di questo sistema ha incluso VP64, un tetramero di VP16 domini, fornendo un ancora più robusto attivazione tasso5,6. Il sistema è stato impiegato con successo per attivare le regioni codificanti e non codificanti mirando ai promotori ed elementi regolatori. Cosa importante, anche se VP64 molecole non modificano direttamente la struttura della cromatina della regione di destinazione, recluta i modificatori di cromatina che legano i risultati nella deposizione dei marchi attivo (l’eucromatina), tra cui come H3/H4 acetilazione e H3-K4 di / Tri-metilazione5,6. Oltre a VP64, la subunità p65 del complesso NF-κB umano ha stata legata alla dCas9/gRNA modulo7. È interessante notare che, il tethering di questi effettori per le regioni a Monte dei siti di inizio di trascrizione (TSSs) e all’interno di promotori si traduce in un’induzione genica forte. Tuttavia, VP64 e p65 effettori possono anche esercitare gli effetti attivatori pur essendo legata alle regioni situate a valle di TSSs e a distale rinforzatori7,8. Per suscitare una risposta trascrizionale più robusta, più fusioni dCas9-VP64 o dCas9-p65 devono essere assunti per un bersaglio singolo locus9,10. Come tale, il recente sviluppo di attivatori di prossima generazione, che reclutano domini effettrici multipli da un singolo dCas9-gRNA complesso, ad esempio SunTag, ha provocato una più forte capacità di attivazione confronto tra al dCas9-VP64 fusione controparti11 , 12. un’attivazione trascrizionale migliore è stato ottenuto mediante la fusione di VP64, p65 e Rta (VPR), un dominio di transattivazione da gamma-herpesvirus, fino al C-terminale di dCas913 (Figura 1A). Simili sistemi di CRISPR/dCas9 sono stati sviluppati per la repressione di target-specifici (Figura 1B).

Repressione del gene endogeno può essere raggiunto con fusioni derivati dal repressore attraverso una varietà di meccanismi (Figura 1B). È stato dimostrato che CRISPR/dCas9 sistemi, collegati al repressore DBD (anche senza un dominio effector/s), in modo efficiente possono tacere l’espressione genica mentre legato ad un promotore o a Monte/a valle-TSS regioni3,6 ,14. Gli effetti sulla trascrizione è causato dall’interferenza sterica del legame del fattore di trascrizione ed elaborazione di RNA polimerasi. Tuttavia, sono necessari approcci più completi, come repressione genica di sterico da solo spesso non è sufficiente per il silenziamento robusto. Il recente sviluppo della prossima generazione di silenziatori basati su sistemi CRISPR/dCas9 che trasportano domini di repressore trascrizionale (TRDs), i modificatori dell’istone (H3-K9 di-/ tri-metilazione, H3-K27 di-/ tri-metilazione; H3-K36 di-/ tri-metilazione, H3/H4 deacetilazione) e portato alla costruzione di strumenti epigenetici che permette più robusto silenziamento effetti4,5,15,16, la metilazione del DNA (CpG) 17,18,19,20. È stato dimostrato che l’assunzione di questi modificatori epigenetici al DNA può condurre alla formazione di più cromatina condensata e chiusa, che genera tipicamente un più potente silenziamento risultato21,22. Il dominio più comunemente silenziamento utilizzato con DBDs è la casella associata Krüppel (KRAB)4,5. L’assunzione del fattore è stata dimostrata per la corrispondenza con le modifiche della cromatina; Tuttavia, i meccanismi di queste modifiche sono ancora di essere chiarito16,17,18. Recentemente, è stato dimostrato che la localizzazione di KRAB al DNA possa promuovere l’Assemblea dell’istone metiltransferasi SETDB1 e i complessi di NuRD istone deacetilazione (HDAC), suggerendo la possibilità che queste interazioni mediano la formazione di condensazione della cromatina e trascrizione silenziante3,13. Come approccio alternativo, domini dell’effettore possono essere fusa a DBDs per creare una proteina di silenziamento epigenetica personalizzata. Questo sistema catalizza direttamente repressiva DNA marchi o modificazioni istoniche.

Recentemente, l’uso di sistemi CRISPR/dCas9 sintetici legato all’enzima di DNMT3A è stato reimpiegato per inattivazione trascrizionale. DNMT3a catalizza la metilazione del DNA che esercita la repressione trascrizionale durante la formazione dell’eterocromatina su promotori di geni endogeni e altre regioni regolarici (Figura 1B)18,20. McDonald et al.18 e Vojta et al.20 sono stati i primi autori a riferire che la metilazione del DNA può essere utilizzata per epigenome-genico o repressione, dimostrando che il sistema di fusione di plasmide-consegnato dCas9-DNMT3A potentemente può migliorare metilazione della citosina intorno il TSS18,20. McDonald e colleghe hanno dimostrato che l’occupazione della strategia può provocare una riduzione significativa (circa il 40%) in un gene oncosoppressore, CDKN2A mRNA livelli18. Allo stesso modo, targeting della regione non metilato promotore dei geni BACH o IL6ST Mostra aumentata metilazione di CpG che è stata correlata con una riduzione di duplice nell’ espressione genica20. Il nostro laboratorio ha recentemente riproposto l’uso di metilazione del DNA per l’attenuazione dei risultati patologici di SNCA sovraespressione (Figura 2)23. La strategia si basa sul potenziamento selettivo nella metilazione del DNA all’interno della regione di introne 1 SNCA , come precedentemente è stato segnalato per essere ipometilato nel PD e demenza con Lewy (DLB) corpi cervelli24,25, 26. Questo hypomethylation è stato collegato alla sovraespressione di SNCA , offrendo così un obiettivo attraente per intervento terapeutico24,27,28. Recentemente abbiamo mostrato un basso livello di metilazione del DNA nel SNCA introne 1 regione in dopaminergici hiPSC-derivati NPC ottenute da un paziente del Palladio con la triplicazione di SNCA 23. Il vantaggio di questo modello sperimentale è che gli NPC possono essere robustamente propagati nella cultura o ulteriormente differenziati nei neuroni maturi, che consente uno screening efficace identificare i fattori genetici che mediano fenotipi cellulari, tra cui ossidativo lo stress e l’apoptosi29. Inoltre, questo sistema modello permette agli scienziati di ricapitolare gli eventi inerenti allo sviluppo che si sono verificati prima dell’insorgenza dei sintomi nei pazienti. Inoltre, hiPSC-derivati NPC rappresentano un ottimo strumento per testare le vie cellulari e molecolari connesse con l’espressione genica. D’importanza, hiPSC-derivati NPC abbinato alla tecnologia state-of-the-art CRISPR/Cas9-epigenome può facilitare notevolmente lo sviluppo di “farmaci di nuova generazione” per molte malattie neurodegenerative.

Per ridurre i livelli patologici di SNCA espressione, abbiamo recentemente sviluppato un sistema basato su lentivirus che trasportano una proteina di fusione dCas9-DNMT3A e gRNA specificamente metilazione di CpG di destinazione all’interno del SNCA introne 1 (Figura 2A)23. Questo protocollo descriverà vettore lentivirale (LV) progettazione e produzione in dettaglio. LVs rappresentano un mezzo efficace di fornire componenti di CRISPR/dCas9 per diversi motivi, vale a dire (i) la loro capacità di trasportare ingombrante DNA inserti, (ii) un’alta efficienza di trasduzione un’ampia gamma di cellule, compreso le cellule di divisione sia nondividing30 e (iii) loro capacità di indurre risposte citotossiche e immunogeniche minimale. Recentemente, abbiamo applicato il sistema di LV a neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente con la triplicazione del locus SNCA e dimostrato il potenziale terapeutico di LVs per la consegna di editing epigenome metilazione23 ( degli strumenti Figura 2B). Infatti, un sistema di LV-gRNA/dCas9-DNMT3A provoca un significativo aumento nella metilazione del DNA alla regione dell’introne 1 SNCA . Questo aumento corrisponde con la riduzione dei livelli di mRNA e proteina SNCA 23. Inoltre, SNCA downregulation Salva fenotipi PD-relative nel SNCA triplicazione/hiPSC-derivato dopaminergico neuroni (ad esempio, mitocondriale ROS produzione e cella vitalità)23. Cosa importante, abbiamo dimostrato che la riduzione dell’espressione di SNCA dal sistema LV-gRNA-dCas9-DMNT3A è in grado di invertire i fenotipi che sono caratteristici per i neuroni dopaminergici hiPSC-derivato da un paziente di PD che ha trasportato il SNCA triplicazione, quali mitocondriale ROS produzione e cellula attuabilità23. L’obiettivo del presente protocollo è 1) per delineare il protocollo di produzione e la concentrazione di una piattaforma ottimizzata di LV per la generazione di alta-risero preparati virali e 2) per descrivere la differenziazione di hiPSCs in NPC modellato per diventare maturo dopaminergici neuroni31,32 e la caratterizzazione dei livelli di metilazione della regione mirata all’interno di SNCA introne 1.

Lentivirali piattaforme hanno un vantaggio importante sopra la piattaforma più popolare di vettore, vale a dire adeno-associato vettori (AAVs), che è capacità l’ex di ospitare grandi inserti genetici33,34. Adenoassociati possono essere generate in rendimenti significativamente più elevati ma possiedono una capacità di confezionamento basso (< 4,8 kb), compromettendo il loro uso per la distribuzione di sistemi CRISPR/Cas9 all-in-one. Così, sembra che il LVs sarebbe la piattaforma di scelta nelle applicazioni coinvolte nella fornitura di strumenti CRISPR/dCas9. Pertanto, il protocollo descritto qui sarà uno strumento prezioso per i ricercatori desiderosi di fornire in modo efficace modifica epigenome componenti di cellule e organi. Il protocollo ulteriormente delinea la strategia per aumentare le capacità di produzione ed espressione dei vettori tramite una modifica in cis degli elementi all'interno del vettore espressione cassetta30,35. La strategia si basa sul romanzo sistema sviluppato e studiato nel nostro laboratorio ed evidenzia la sua capacità di produrre particelle virali nella gamma di 1010 unità virali (VU) / ml30,35.

Protocol

1. sistema progettazione e produzione di Virus Costruzione e progettazione di plasmideNota: La costruzione di un vettore di LV-gRNA-dCas9-DNMT3A all-in-one viene eseguita utilizzando una produzione- e cassetta di espressione espressione-ottimizzata pubblicato da Ortinski et al.30. La cassetta di vettore trasporta una ripetizione del sito riconoscimento del fattore di trascrizione Sp1 e un’omissione di state-of-the-art all’interno il non tradotte (U3’…

Representative Results

Convalida dei titoli di produzione dei vettori LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro rispetto alla controparte GFP ingenuo Abbiamo effettuato p24gag ELISA da confrontare tra titoli fisici di LV-dCas9-DNMT3A-GFP/Puro con le controparti GFP/Puro ingenuo. Risultati rappresentativi, presentati in Figura 5A, dimostrano che rese fisiche dei vettori, generati utilizzando il protocollo descri…

Discussion

LVs hanno cominciato ad emergere come il veicolo della scelta per l’editing di epigenoma, soprattutto nel contesto delle malattie genetiche, principalmente dovuto la loro capacità di (i) di ospitare grandi carichi utili di DNA e (ii) trasducono efficientemente una vasta gamma di divisione e cellule nondividing. L’efficacia di grande imballaggio del LVs è particolarmente utile per le applicazioni che coinvolgono imballaggio dei sistemi CRISPR/dCas9 che sono di grandi dimensioni. Da questa prospettiva, LVs rappresentano …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato finanziato in parte dal Kahn neurotecnologie Development Award (di O.C.) e istituti di salute nazionale Istituto nazionale dei disordini neurologici e colpo (NINDS/NIH) (R01 NS085011 di O.C.).

Materials

Equipment
Optima XPN-80 Ultracentrifuge Beckman Coulter A99839
0.22 μM filter unit, 1L Corning 430513
0.45-μm filter unit, 500mL Corning 430773
100mm TC-Treated Culture Dish Corning 430167
15 mL conical centrifuge tubes Corning 430791
150 mm TC-Treated Cell Culture dishes with 20 mm Grid Corning 353025
50mL conical centrifuge tubes Corning 430291
6-well plates Corning 3516
Aggrewell 800 StemCell Technologies 34811
Allegra 25R tabletop centrifuge Beckman Coulter 369434
BD FACS Becton Dickinson 338960
Conical bottom ultracentrifugation tubes Seton Scientific 5067
Conical tube adapters Seton Scientific PN 4230
Eppendorf Cell Imaging Slides Eppendorf 30742060
High-binding 96-well plates Corning 3366
Inverted fluorescence microscope Leica DM IRB2
QIAprep Spin Miniprep Kit (50) Qiagen 27104
Reversible Strainer StemCell Technologies 27215
SW32Ti rotor Beckman Coulter 369650
VWR® Disposable Serological Pipets, Glass, Nonpyrogenic VWR 93000-694
VWR® Vacuum Filtration Systems VWR 89220-694
xMark™ Microplate Absorbance plate reader Bio-Rad 1681150
Name Company Catalog Number Comments
Cell culture reagents
Human embryonic kidney 293T (HEK 293T) cells ATCC CRL-3216
Accutase StemCell Technologies 7920
Anti-Adherence Rinsing Solution StemCell Technologies 7010
Anti-FOXA2 Antibody Abcam Ab60721
Anti-Nestin Antibody Abcam Ab18102
Antibiotic-antimycotic solution, 100X Sigma Aldrich A5955-100ML
B-27 Supplement (50X), minus vitamin A Thermo Fisher Scientific 12587010
BES Sigma Aldrich B9879 – BES
Bovine Albumin Fraction V (7.5% solution) Thermo Fisher Scientific 15260037
CHIR99021 StemCell Technologies 72052
Corning Matrigel hESC-Qualified Matrix Corning 08-774-552
Cosmic Calf Serum Hyclone SH30087.04
DMEM-F12 Lonza 12-719
DMEM, high glucose media Gibco 11965
DNeasy Blood & Tissue Kit Qiagen 69504
EpiTect PCR Control DNA Set Qiagen 596945
EZ DNA Methylation Kit Zymo Research D5001
Gelatin Sigma Aldrich G1800-100G
Gentamicin Thermo Fisher Scientific 15750078
Gentle Cell Dissociation Reagent stemCell Technologies 7174
GlutaMAX Thermo Fisher Scientific 35050061
Human Recombinant bFGF StemCell Technologies 78003
Human Recombinant EGF StemCell Technologies 78006
Human Recombinant Shh (C24II) StemCell Technologies 78065
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) Thermo Fisher Scientific 11140050
mTeSR1 StemCell Technologies 85850
N-2 Supplement (100X) Thermo Fisher Scientific 17502001
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049
Non-Essential Amino Acid (NEAA) Hyclone SH30087.04
PyroMark PCR Kit Qiagen 978703
RPMI 1640 media Thermo Fisher Scientific 11875-085
SB431542 StemCell Technologies 72232
Sodium pyruvate Sigma Aldrich S8636-100ML
STEMdiff Neural Induction Medium StemCell Technologies 5835
STEMdiff Neural Progenitor Freezing Medium StemCell Technologies 5838
TaqMan Assay FOXA2 Thermo Fisher Scientific Hs00232764
TaqMan Assay GAPDH Thermo Fisher Scientific Hs99999905
TaqMan Assay Nestin Thermo Fisher Scientific Hs04187831
TaqMan Assay OCT4 Thermo Fisher Scientific Hs04260367
TaqMan Assay PPIA Thermo Fisher Scientific Hs99999904
Trypsin-EDTA 0.05% Gibco 25300054
Y27632 StemCell Technologies 72302
Name Company Catalog Number Comments
p24 ELISA reagents
Monoclonal anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program 3537
Goat anti-rabbit horseradish peroxidase IgG Sigma Aldrich 12-348 Working concentration 1:1500
Goat serum, Sterile, 10mL Sigma G9023 Working concentration 1:1000
HIV-1 standards NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP968F
Normal mouse serum, Sterile, 500mL Equitech-Bio SM30-0500
Polyclonal rabbit anti-p24 antibody NIH AIDS Research and Reference Reagent Program SP451T
TMB peroxidase substrate KPL 5120-0076 Working concentration 1:10,000
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pMD2.G Addgene 12253
pRSV-Rev Addgene 52961
psPAX2 Addgene 12259
Name Company Catalog Number Comments
Restriction enzymes
BsmBI New England Biolabs R0580S
BsrGI New England Biolabs R0575S
EcoRV New England Biolabs R0195S
KpnI New England Biolabs R0142S
PacI New England Biolabs R0547S
SphI New England Biolabs R0182S

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Tagliafierro, L., Ilich, E., Moncalvo, M., Gu, J., Sriskanda, A., Grenier, C., Murphy, S. K., Chiba-Falek, O., Kantor, B. Lentiviral Vector Platform for the Efficient Delivery of Epigenome-editing Tools into Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Disease Models. J. Vis. Exp. (145), e59241, doi:10.3791/59241 (2019).

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