そのまま線虫の酸素消費量の測定
Summary
ミトコンドリアの呼吸は生物の生存にとって重要ですしたがって、酸素消費量は、ミトコンドリアの健康の優れた指標です。このプロトコルでは基底を測定する市販の呼吸の使用を述べるし、最大酸素消費量のライブ、線虫そのまま・自由に運動。
Abstract
最適なミトコンドリアの機能は、これら神経系および筋のような高いエネルギー需要を持つセルを中心に、健康な細胞の活動にとって重要です。一貫性のある、このミトコンドリア機能障害は無数の神経変性疾患と一般的に高齢化に関連付けられています。線虫は、ミトコンドリア機能の多くの複雑さを解明するための強力なモデル システムをされています。ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能の強力な指標と最近開発された respirometers は、細胞内呼吸を測定する最新のプラットフォームを提供します。このプロトコルでは、ライブ、そのままc. の elegansの解析手法を提供します。このプロトコルは 〜 7 日間の期間にわたる、(1) 成長と注入する化合物の線虫、 (2) の合成とプローブ、(3) 薬剤の読み込みとカートリッジの平衡、ワームの分析の準備 (4) 水和の同期するための手順が含まれていますプレートと分析を実行すると、(5) の後の実験データ解析。
Introduction
アデノシン三リン酸塩 (ATP)、細胞のエネルギーの主要なソースは、ミトコンドリアの電子輸送鎖 (ETC) 内のミトコンドリアの膜にある酵素によって生成されます。ピルビン酸は、ミトコンドリアの ATP の生産に利用されている主要代謝物は、ベタニン脱炭酸アセチル補酵素 A (CoA) を生成する、ミトコンドリア マトリックスにインポートされます。その後、アセチル CoA はクエン酸ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) キー電子キャリア分子の生成に終ってを入力します。NADH から電子が酸素に ETC 経由で渡されるとき、プロトンは膜間で電気化学的勾配の世代で結果ミトコンドリアの膜間スペースに蓄積します。これらのプロトンは、ATP 合成酵素、ATP1 (図 1) の合成とその回転を運転のプロトン通過孔を介してミトコンドリア マトリックスに戻って、この電気化学的勾配にわたって膜間腔からフローさせます。
ミトコンドリアの機能はエネルギー生産に限定されていませんがカルシウムの恒常性、活性酸素種 (ROS) 清掃、アポトーシス、個体の健康2に批判的に位置決めの機能に重要なも。ミトコンドリアの機能は、様々 なアッセイ、ミトコンドリアの膜電位を測定解析、ATP と ROS レベル、およびミトコンドリアのカルシウム濃度に限らずを使用して評価できます。ただし、これらの試金はミトコンドリア機能の単一のスナップショットを提供する、したがってミトコンドリア健康の包括的なビューを提供可能性があります。ATP の生成中に酸素消費量は逐次反応の無数に依存して、のでそれはミトコンドリア機能の優れた指標として役立ちます。興味深いことに、ミトコンドリア機能障害3,4、5の結果として酸素消費量の変化が観察されています。
2 つのグループに大別することができます技術を使用して生体試料の酸素消費量 (OCR) を測定することができます: アンペロ メトリック酸素センサー、酸素6で急冷することができますしたポルフィリンの蛍光体。電流検出型酸素センサーは、メジャー OCR 培養細胞、組織、や線虫などのモデル システムに広く使用されています。ただし、respirometers を含むポルフィリンを用いた蛍光体は、次の利点を所有している: (1) 彼らは、3 通、2 つのサンプルの横に並べて比較 (2) 彼らが必要なサンプル サイズを小さく (など 〜 2、000−5、対ウェルあたり 20 ワーム 000 ワーム、商工会議所)7、および (3) 呼吸度計をプログラムすることで 4 つの異なる化合物注射を行う目的の手動でのアプリケーションの必要性を除去する実験の実行の時刻。
このプロトコルではライブ、そのままc. の elegansのメジャー OCR にポルフィリンを用いた酸素センサー計の使用に関連する手順が記述されていた.大判、高スループット計8の使用のための書かれたプロトコルがこのプロトコル詳細予算友好的、アクセスと小さくスケール計測器で使用するために対応しています。このプロトコルは、2 株が高スループット スクリーニングは必須ではありませんあり、その使用が過度の OCR の違いを評価する場合に特に便利です。
Protocol
Representative Results
Discussion
ミトコンドリアの呼吸はミトコンドリア機能; の洞察力に富んだインジケーターです。したがって、体外か体内かどうか生物学的システムの酸素消費量を測定することは非常に貴重です。Respirometers 酸素または酸素分圧に比例した流れ電気の世代に依存する電流検出型酸素センサーを介して取得急冷したポルフィリンの蛍光体を使用して酸素レベルを感じる。クラーク電極は後者のカテゴリに…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者は、ラボでタツノオトシゴ XFp の確立に彼の指導の博士ケビン Bittman を認めたいと思います。健康の国民の協会は、GM088213 はこの仕事を支えたを付与します。
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
- Nelson, D. L., Cox, M. M., Ahr, K. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. , 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al. Presenilin mutations deregulate mitochondrial Ca(2+) homeostasis and metabolic activity causing neurodegeneration in Caenorhabditis elegans. eLife. 7, (2018).
- Luz, A. L., et al. Mitochondrial Morphology and Fundamental Parameters of the Mitochondrial Respiratory Chain Are Altered in Caenorhabditis elegans Strains Deficient in Mitochondrial Dynamics and Homeostasis Processes. PLoS One. 10, e0130940 (2015).
- Ryu, D., et al. Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C. elegans and increases muscle function in rodents. Nature Medicine. 22, 879-888 (2016).
- Perry, C. G., Kane, D. A., Lanza, I. R., Neufer, P. D. Methods for assessing mitochondrial function in diabetes. Diabetes. 62, 1041-1053 (2013).
- Schulz, T. J., et al. Glucose restriction extends Caenorhabditis elegans life span by inducing mitochondrial respiration and increasing oxidative stress. Cell Metabolism. 6, 280-293 (2007).
- Koopman, M., et al. A screening-based platform for the assessment of cellular respiration in Caenorhabditis elegans. Nature Protocols. 11, 1798-1816 (2016).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Analysis of Mitochondrial Structure in the Body Wall Muscle of Caenorhabditis elegans. Bio-protocol. 8, (2018).
- Sarasija, S., Norman, K. R. Measurement of ROS in Caenorhabditis elegans Using a Reduced Form of Fluorescein. Bio-protocol. 8, (2018).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. Journal of Visualized Experiments. 47 (47), (2011).
- Aitlhadj, L., Sturzenbaum, S. R. The use of FUdR can cause prolonged longevity in mutant nematodes. Mechanisms of Ageing and Development. 131, 364-365 (2010).
- Rooney, J. P., et al. Effects of 5′-fluoro-2-deoxyuridine on mitochondrial biology in Caenorhabditis elegans. Experimental Gerontology. 56, 69-76 (2014).
- Van Raamsdonk, J. M., Hekimi, S. FUdR causes a twofold increase in the lifespan of the mitochondrial mutant gas-1. Mechanisms of Ageing and Development. 132, 519-521 (2011).
- Heytler, P. G., Prichard, W. W. A new class of uncoupling agents–carbonyl cyanide phenylhydrazones. Biochemical and Biophysical Research Communications. 7, 272-275 (1962).
- Massie, M. R., Lapoczka, E. M., Boggs, K. D., Stine, K. E., White, G. E. Exposure to the metabolic inhibitor sodium azide induces stress protein expression and thermotolerance in the nematode Caenorhabditis elegans. Cell Stress Chaperones. 8, 1-7 (2003).
- Levitan, D., Greenwald, I. Facilitation of lin-12-mediated signalling by sel-12, a Caenorhabditis elegans S182 Alzheimer’s disease gene. Nature. 377, 351-354 (1995).
- Sherrington, R., et al. Cloning of a gene bearing missense mutations in early-onset familial Alzheimer’s disease. Nature. 375, 754-760 (1995).
- Glancy, B., Balaban, R. S. Role of mitochondrial Ca2+ in the regulation of cellular energetics. Biochemistry. 51, 2959-2973 (2012).
- Sarasija, S., Norman, K. R. A gamma-Secretase Independent Role for Presenilin in Calcium Homeostasis Impacts Mitochondrial Function and Morphology in Caenorhabditis elegans. Genetics. 201, 1453-1466 (2015).
