Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans
Summary
La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l’uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.
Abstract
La funzione mitocondriale ottimale è critica per l’attività cellulare sano, particolarmente in cellule che hanno richieste di alta energia come quelli del sistema nervoso e muscolare. Coerente con questo, la disfunzione mitocondriale è stata associata con una miriade di malattie neurodegenerative e invecchiamento in generale. Caenorhabditis elegans sono stati un sistema potente modello per chiarire le molte complessità della funzione mitocondriale. La respirazione mitocondriale è un forte indicatore della funzione mitocondriale e sviluppata di recente respirometers offrire una piattaforma di state-of-the-art per misurare la respirazione in cellule. In questo protocollo, mettiamo a disposizione una tecnica per analizzare dal vivo, intatto di c. elegans. Questo protocollo si estende su un periodo di ~ 7 giorni e include passaggi per la coltivazione e la sincronizzazione di c. elegans, (2) preparazione di composti da iniettare e idratazione di sonde, equilibrazione di caricamento e cartuccia di droga (3), (4) preparazione del dosaggio di vite senza fine (1) piatto e analisi del saggio e analisi dei dati post-esperimento (5).
Introduction
L’adenosina trifosfato (ATP), la principale fonte di energia cellulare, è prodotto nei mitocondri dagli enzimi della catena di trasporto dell’elettrone (ecc) situati nella membrana mitocondriale interna. Piruvato, un metabolita chiave utilizzato per la produzione mitocondriale di ATP, viene importato nella matrice mitocondriale dove è decarbossilata a produrre acetil coenzima A (CoA). Successivamente, acetil CoA entra nel ciclo dell’acido citrico conseguente generazione di nicotinamide adenindinucleotide (NADH), una molecola del trasportatore di elettrone chiave. Come gli elettroni dal NADH sono passati all’ossigeno tramite l’ecc, protoni costruire nello spazio intermembrana mitocondriale, che provoca la generazione di un gradiente elettrochimico attraverso la membrana. Questi protoni scorrerà quindi dallo spazio intermembrana attraverso questo gradiente elettrochimico indietro nella matrice mitocondriale attraverso il poro del protone del trifosfato di adenosina synthase, guidando la sua rotazione e la sintesi di ATP1 (Figura 1).
La funzione mitocondriale non è limitata alla produzione di energia, ma è anche fondamentale per l’omeostasi del calcio, specie reattive dell’ossigeno (ROS) lo scavenging e apoptosi, posizionamento criticamente la loro funzione in organismal salute2. La funzione mitocondriale può essere valutata utilizzando una varietà di saggi, compreso ma non limitato all’analisi che misurano il potenziale di membrana mitocondriale, livelli di ATP e ROS e le concentrazioni nel calcio mitocondriale. Tuttavia, queste analisi forniscono un singolo snapshot della funzione mitocondriale e pertanto potrebbero non fornire una visione completa della salute mitocondriale. Poiché il consumo di ossigeno durante la generazione di ATP fa affidamento su una miriade di reazioni sequenziale, serve come un indicatore superiore della funzione mitocondriale. Interessante, sono state osservate variazioni nei tassi di consumo di ossigeno a causa di disfunzione mitocondriale3,4,5.
I tassi di consumo di ossigeno (OCR) di campioni viventi possono essere misurati usando le tecniche che possono essere suddivisi in due gruppi: amperometrico sensori di ossigeno e base porfirinica fosfori che possono essere spenta mediante ossigeno6. Sensori di ossigeno amperometrico sono stati ampiamente utilizzati su misura OCR in cellule coltivate, tessuti e in sistemi modello, ad esempio c. elegans. Tuttavia, i fosfori base porfirinica contenente respirometers possiedono i seguenti vantaggi: (1) essi consentono un confronto fianco a fianco dei due campioni in triplice copia, (2) richiedono più piccola dimensione del campione (per esempio, 20 worms per pozzetto contro ~ 2, 000−5, 000 worm sezione)7e (3) il respirometro può essere programmato per fare quattro distinte iniezioni composte al desiderato volte nel corso della tiratura sperimentale, eliminando la necessità per l’applicazione manuale.
In questo protocollo, passaggi coinvolti nell’utilizzo di un respirometro di rilevamento dell’ossigeno base porfirinica su misura OCR in live, intatto di c. elegans sono descritti. Mentre esiste un protocollo scritto per l’uso del grande formato, elevato throughput respirometro8, questo protocollo è stato adattato per l’uso con uno strumento di cordiale, accessibile e più piccola scala di bilancio più. Questo protocollo è particolarmente utile per valutare la differenza in OCR tra due ceppi, dove high throughput screening non è necessario e il suo utilizzo sarebbe eccessivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
La respirazione mitocondriale è un indicatore penetrante della funzione mitocondriale; Pertanto, è in grado di misurare i tassi di consumo di ossigeno in un sistema biologico, sia in vitro che in vivo è molto prezioso. Respirometers rilevare i livelli di ossigeno utilizzando base porfirinica fosfori che ottenere placati da ossigeno o tramite sensori di ossigeno amperometrico che si basano sulla generazione di una corrente elettrica proporzionale alla pressione di ossigeno. Elettrodo di Clark rientra nella categoria di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori desidera ringraziare il Dr. Kevin Bittman per la sua guida nello stabilire la Seahorse XFp in laboratorio. National Institutes of Health concedere che gm088213 sostenuto questo lavoro.
Materials
| 100 mm, 60 mm Petri dishes | Kord-Valmark Labware Products | 2900, 2901 | |
| 1.5 mL centrifuge tubes | Globe Scientific | 6285 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm coverslip | Globe Scientific | 1404-10 | |
| 50 mL conical tubes | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto tryptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bacto yeast extract | BD, Bacto | 212705 | |
| Bleach | Generic | ||
| Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Cholesterol | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Deionized water (dH2O) | |||
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Glass Pasteur pipettes | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate (MgSO4·7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Potassium phosphate dibasic (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Potassium phosphate monobasic (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Sodium hydroxide (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodium phosphate dibasic anhydrous (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
References
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