La respirazione mitocondriale è fondamentale per la sopravvivenza organismal; Pertanto, il tasso di consumo di ossigeno è un eccellente indicatore della salute mitocondriale. In questo protocollo, descriviamo l'uso di un respirometro commercialmente disponibile per misurare basale e tassi di consumo di ossigeno massimo nel vivere, intatta e liberamente-motile Caenorhabditis elegans.
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Articolo metodologico
Misurazione dei tassi di consumo di ossigeno in intatto Caenorhabditis elegans
In questo articolo
Sommario
Abstract
La funzione mitocondriale ottimale è critica per l'attività cellulare sano, particolarmente in cellule che hanno richieste di alta energia come quelli del sistema nervoso e muscolare. Coerente con questo, la disfunzione mitocondriale è stata associata con una miriade di malattie neurodegenerative e invecchiamento in generale. Caenorhabditis elegans sono stati un sistema potente modello per chiarire le molte complessità della funzione mitocondriale. La respirazione mitocondriale è un forte indicatore della funzione mitocondriale e sviluppata di recente respirometers offrire una piattaforma di state-of-the-art per misurare la respirazione in cellule. In questo protocollo, mettiamo a disposizione una tecnica per analizzare dal vivo, intatto di c. elegans. Questo protocollo si estende su un periodo di ~ 7 giorni e include passaggi per la coltivazione e la sincronizzazione di c. elegans, (2) preparazione di composti da iniettare e idratazione di sonde, equilibrazione di caricamento e cartuccia di droga (3), (4) preparazione del dosaggio di vite senza fine (1) piatto e analisi del saggio e analisi dei dati post-esperimento (5).
Introduzione
L'adenosina trifosfato (ATP), la principale fonte di energia cellulare, è prodotto nei mitocondri dagli enzimi della catena di trasporto dell'elettrone (ecc) situati nella membrana mitocondriale interna. Piruvato, un metabolita chiave utilizzato per la produzione mitocondriale di ATP, viene importato nella matrice mitocondriale dove è decarbossilata a produrre acetil coenzima A (CoA). Successivamente, acetil CoA entra nel ciclo dell'acido citrico conseguente generazione di nicotinamide adenindinucleotide (NADH), una molecola del trasportatore di elettrone chiave. Come gli elettroni dal NADH sono passati all'ossigeno tramite l'ecc, protoni costruire nello spazio interm....
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Protocollo
Nota: Nella figura 2 fornisce una descrizione schematica del protocollo completo.
1. crescita e sincronizzazione di popolazione del nematode9,10
- Trasferire le larve L4 di ambiti di provenienza genetici desiderate (ad es., N2 [wild-type] e sel-12 animali) sulle piastre di supporto (NGM) crescita del nematode (Vedi tabella 1 per ricetta) appena seminati con un prato di Escherichia coli (OP50)11. Utilizzare 100mm almeno due o tre piastre di 60 mm per ogni sforzo. Incubare i vermi alla temperatura ....
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Risultati
Utilizzando il protocollo descritto nel presente documento, OCR di tipo selvaggio animali e tre diversi sel-12 mutante ceppi sono stati determinati. SEL-12 codifica l'ortologo di c. elegans di presenilin17. Le mutazioni presenilin umana sono l'aberrazione genetica più comune connesso con lo sviluppo del morbo di Alzheimer familiare18. Nostri studi hanno mostrato i livelli elevati del calcio mitocondriale in sel.......
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Discussione
La respirazione mitocondriale è un indicatore penetrante della funzione mitocondriale; Pertanto, è in grado di misurare i tassi di consumo di ossigeno in un sistema biologico, sia in vitro che in vivo è molto prezioso. Respirometers rilevare i livelli di ossigeno utilizzando base porfirinica fosfori che ottenere placati da ossigeno o tramite sensori di ossigeno amperometrico che si basano sulla generazione di una corrente elettrica proporzionale alla pressione di ossigeno. Elettrodo di Clark rientra nella categoria di qu.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Ringraziamenti
Gli autori desidera ringraziare il Dr. Kevin Bittman per la sua guida nello stabilire la Seahorse XFp in laboratorio. National Institutes of Health concedere che gm088213 sostenuto questo lavoro.
....Accesso limitato. Accedi o avvia una prova gratuita per visualizzare questo contenuto.
Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Piastre di Petri da 100 mm, 60 mm | Kord-Valmark Labware Prodotti | 2900, 2901 | |
| Provette da centrifuga da 1,5 mL | Globe Scientific | 6285 | |
| Provette coniche da 15 mL | Corning | 430791 | |
| 22 × 22 mm Vetrino coprioggetti | Globe Scientific | 1404-10 | |
| Provette coniche da 50 mL | Corning | 430829 | |
| Agar | Fisher Scientific | BP1423-2 | |
| Bacto peptone | BD, Bacto | 211677 | |
| Bacto triptone | BD, Bacto | 211705 | |
| Bleach | Generico | ||
| Cloruro di calcio diidrato (CaCl2· 2H2O) | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Cianuro di carbonile 4-(trifluorometossi)fenilidrazone (FCCP) | Abcam | ab120081 | |
| Colesterolo | Fisher Scientific | C314-500 | |
| Acqua deionizzata (dH2O) | |||
| Dimetil solfossido (DMSO) | Thomas Scientific | C987Y85 | |
| Pipette in vetro Pasteur | Krackeler Scientific | 6-72050-900 | |
| Solfato di magnesio eptaidrato (MgSO4· 7H2O) | Fisher Scientific | BP213-1 | |
| Fosfato di potassio bibasico (K2HPO4) | Fisher Scientific | BP363-1 | |
| Fosfato di potassio monobasico (KH2PO4) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Cloruro di sodio | Fisher Scientific | BP358-10 | |
| Idrossido di sodio (NaOH) | Fisher Scientific | BP359-500 | |
| Sodio fosfato bibasico anidro (Na2HPO4) | Fisher Scientific | BP332-1 | |
| Seahorse XFp Analyzer | Agilent | ||
| Seahorse XFp FluxPak | Agilent | 103022-100 | |
| Sodio azide | Sigma-Aldrich | S2002 |
Riferimenti
- Nelson, D. L., Cox, M. M. Ch. 19. Lehninger Principles of Biochemistry. Ahr, K. , W. H. Freeman and Company. 707-772 (2008).
- Marchi, S., et al. Mitochondrial and endoplasmic reticulum calcium homeostasis and cell death. Cell Calcium. 69, 62-72 (2018).
- Sarasija, S., et al.
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Ristampe e permessi
