Summary
Nous présentons ici un protocole pour humain isolement des cellules souches pulpe dentaire et propagation afin d’évaluer l’expression de la protéine prion au cours du processus de différenciation neuronale.
Abstract
Les enjeux éthiques associés à la manipulation des cellules souches embryonnaires ont entravé les progrès dans le domaine de la recherche médicale. Pour cette raison, il est très important d’obtenir des cellules souches adultes de différents tissus tels que les tissus adipeux, cordon ombilical, la moelle osseuse et le sang. Parmi les sources possibles, la pulpe dentaire est particulièrement intéressant parce qu’il est facile d’obtenir en ce qui concerne les considérations bioéthiques. En effet, Dental Pulp des cellules souches humaines (hDPSCs) sont un type de cellules souches adultes capables de se différencier en cellules neuronales semblables et peuvent provenir de la troisième molaire des patients en bonne santé (âgés de 13 à 19). En particulier, la pulpe dentaire a été enlevée avec une excavatrice, coupée en petites tranches, traitée par collagénase IV et cultivée dans un ballon jaugé. Pour induire la différenciation neuronale, hDPSCs ont été stimulées avec EGF/bFGF pendant 2 semaines. Auparavant, nous avons démontré qu’au cours du processus de différenciation de prion cellulaire protéine (PrPC) en hDPSCs augmenté. L’analyse cytofluorométrique ont montré une expression précoce de la PrPC qui a augmenté après le processus de différenciation neuronale. Ablation de la PrPC de siARN PrP a empêché la différenciation neuronale induite par l’EGF/bFGF. Dans cet article, Nous illustrons que que nous avons amélioré l’isolement, de séparation et de méthodes de culture in vitro de hDPSCs avec plusieurs opérations simples, les clones de cellules plus efficaces étaient expansion obtenue et à grande échelle des cellules souches mésenchymateuses (CSM) a été observée. Nous montrons aussi comment les hDPSCs, obtenues avec les méthodes décrites dans le protocole, sont un excellent modèle expérimental pour étudier le processus de différenciation neuronale de MSCs et procédés cellulaires et moléculaires.
Introduction
Cellules souches mésenchymateuses ont été isolées de divers tissus, y compris la moelle osseuse, sang de cordon ombilical, pulpe dentaire humain, le tissu adipeux et sang1,2,3,4,5 , 6. comme indiqué par plusieurs auteurs, hDPSCs montrent une adhésion en plastique, une morphologie typique des fibroblastes. Il s’agit d’une population très hétérogène avec des clones distincts et les différences dans la capacité de prolifération et de différenciation7,8. hDPSCs expriment des marqueurs spécifiques des cellules souches mésenchymateuses (CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1), ils sont négatifs pour certains marqueurs hématopoïétiques (comme CD14 et CD19) et sont capables de différenciation multilignée in vitro9, 10,11.
Plusieurs auteurs ont montré que ces cellules sont capables de se différencier en cellules de neurone comme utilisant des protocoles différents, qui comprennent l’ajout de NGF, bFGF, EGF en combinaison avec le spécifique médias et suppléments7,12. En outre, beaucoup de protéines est impliquées au cours du processus de différenciation neuronale et, parmi ceux-ci, plusieurs journaux montre un rôle pertinent et une expression significative de la protéine prion cellulaire (PrPC), aussi bien dans les cellules souches embryonnaires et adultes13, 14. PrPC représente une molécule pléiotrope capable de remplir des fonctions différentes à l’intérieur de cellules dans le métabolisme du cuivre, l’apoptose, et résistance à l’oxydation stress15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Dans notre précédente du livre23, nous avons examiné le rôle de la PrPC dans le processus de différenciation neuronale hDPSCs. En fait, hDPSCs exprimer précocement PrPC et, après la différenciation neuronale, il était possible d’observer une augmentation supplémentaire. D’autres auteurs l’hypothèse d’un rôle possible de la PrPC dans les processus de différenciation neuronale de cellules souches. En effet, PrPC entraîne la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines dans les neurones, les astrocytes et oligodendrocytes24. Le but de cette étude était de mettre l’accent sur la méthodologie pour l’obtention de cellules souches de la pulpe dentaire, ses processus de différenciation et le rôle de la PrPC au cours de la différenciation neuronale.
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Protocol
Troisièmes molaires utilisés dans l’étude ont été excisés de patients (13-19 ans) avec aucun antécédent de consommation d’alcool ou de drogue, toutes non-fumeurs et avec une bonne hygiène buccale. Le jour de l’explication, au département de Science dentaire et maxillo-faciale de l’Université « La Sapienza » de Rome, le consentement éclairé a été obtenu depuis les patients ou les parents. Le consentement éclairé a été obtenu basée sur des considérations éthiques et à l’approbation du comité d’éthique.
1. dents et Extraction de la pulpe dentaire
-
Préparation du support approprié pour la conservation ou le transport.
- Préparer moyen faible concentration de l’aigle de la modification de Dulbecco de glucose (DMEM-L) en L-glutamine (494,5 mL).
- Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %) et 0,5 mL d’amphotéricine (0,1 %).
- Extrait le patient de la troisième molaire, rapidement, rincez-le avec du PBS, mis dans un tube de 15 mL avec le milieu et transférez-le au laboratoire en moins de 2 h.
- Sous une hotte de biohazard, ouvrir la dent avec un cutter en passe d’usinage coronale parallèle et tangent à travers le toit de la chambre pulpaire.
- Doucement, retirer la pulpe avec une petite pelle et placez-le dans un tube à essai.
- Laver trois fois, avec du PBS et centrifuger à 2 500 g pendant 10 min à température ambiante.
2. le traitement de la pulpe dentaire et la libération de cellules souches
- Retirez le surnageant, resuspendre le culot dans une solution de Hank et placez-le dans une boîte de pétri. Incuber pendant 2 h à 37 ° C à 5 % de CO2.
-
Préparation de solutions IV collagénase de type.
- Préparation de 0,8 mL de DMEM-L.
- Faire fondre 1 mg de collagénase IV type de 0,8 mL de DMEM-L et vortexer pendant plusieurs minutes.
- Ajouter DMEM-L à 1 mL d’avoir une concentration finale de 1 mg/mL.
- Filtrer la solution avec un filtre de 0,22 µM.
- Enlever la solution de Hank par centrifugation à 2 500 g pendant 10 min à la droite et diviser la pâte en petites tranches approximativement 1 mm chacun avec un scalpel jetable.
- Déposer les tranches de pâte dans un plat de Pétri et incuber 1 ml de collagénase de type IV pendant 15 min à 37 ° C à 5 % de CO2.
-
Préparation de culture moyenne (500 mL).
- À 445 mL de DMEM-L en L-glutamine.
- Ajouter 50 mL de sérum fœtal (SVF) (10 %).
- Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %).
- Centrifuger l’échantillon à 2 500 g pendant 10 min à ta, retirez le surnageant, resuspendre le culot dans le milieu (étape 2.5) et la culture dans ballon T25 spécifique des cellules souches à 37 ° C à 5 % de CO2.
3. propagation et Culture cellules souches
- Chaque jour vérifier la culture et, après 3 jours de croissance, observer différents clones de cellules adhérentes dans la fiole.
- Tous les 3 jours changer le milieu de culture.
- Entre 7 et 12 jours, une fois que les cellules adhérentes ont portée confluence, détacher en traitant les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou doucement en utilisant un grattoir de cellules.
- Ajouter 4 ml (ratio 1:5) bouillon de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine.
- Centrifuger la suspension cellulaire pendant 6 min à 259 x g, éliminer le surnageant et placer les cellules dans une fiole de T25 pour se propager.
Remarque : Tous les 3 jours les cellules atteignent la confluence. - Propager les cellules jusqu'à 21 ou 28 jours (environ 6 à 8 passages) afin d’éviter la présence de souches non-comme des cellules dans la culture.
- Détacher les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou en grattant doucement. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 6 min à 259 x g.
- Retirez le surnageant et tester les cellules pour analyse cytofluorométrique (étape 6).
4. transitoire PrPC arreter de siARN
- Culture les plaques 6 puits de hDPSCsin (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5) pendant 24 h.
-
Le lendemain, préparer des siARN PrP milieu (400 µL).
- Dans un tube à essais stérile, ajouter µL 384 DMEM-L.
- Ajouter 1 µL pour chaque type de siARN PrP à DMEM-L afin d’obtenir une concentration finale de 5 nM (4 siARN PrP ont été utilisés et vérifiés par le fournisseur pour garantir une efficacité défiant ≥70 %).
- Ajouter 12 µL de transfectionreagent à DMEM-L.
- Le mélange de vortex et incuber pendant 10 min à RT pour permettre la formation de complexes de transfection.
- Ajouter 400 μL de siARN PrP moyen dans chaque échantillon et incuber pendant 6 h à 37 ° C.
- Sans jeter le siARN PrP moyen, ajouter 1,6 mL (ratio de 1 à 5) du milieu de culture (étape 2.5).
- Laissez les cellules pendant 72 h à 37 ° C.
- Éliminer le surnageant et laver 3 fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.
- Ajouter 2 mL de milieu de culture neuronale pendant 7 ou 14 jours (étape 5.1).
- Changer le milieu de culture neuronal tous les 3 jours.
Remarque : Remplacer le siARN PrP solution chaque remplacement de temps le milieu de culture neuronal. - À la fin de l’époque, laver 3 fois avec 2 mL de PBS à ta et tester des antigènes de surface neuronales à l’analyse Western Blot.
5. neuronale processus d’Induction de hDPSCs
-
Préparation du milieu de culture neuronale (500 mL).
- Préparer 444,7 mL de milieu de base formulés aux cellules neuronales.
- Au milieu, ajouter 50 mL de supplément sans sérum utilisé pour soutenir la viabilité à long terme des adultes et embryonnaires cellules souches neuronales (10 %).
- Ajouter 200 µL de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) (concentration finale de 40 ng/mL) et 100 µL de facteur de croissance épidermique (EGF) au milieu (concentration finale 20 ng/mL).
- Ajouter 5 mL de pénicilline/streptomycine (1 %) dans le milieu.
- La culture hDPSCs à plaques 6 puits (2 x 105 cellules/mL) jusqu'à 28 jours de la séparation de la pulpe et de les stimuler avec 2 mL de milieu de culture neuronale.
- Tous les 3 jours jeter le surnageant, laver 3 fois avec 2 mL de PBS à RT et remplacer 2 mL de milieu de culture neuronal.
- Après 7 ou 14 jours, détacher les cellules avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou délicatement avec une spatule.
- Ajouter 4 mL (ratio 1:5) du milieu de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine.
- Tester la présence d’antigènes de surface neuronales (étape 6) ou l’expression de la protéine prion (étape 7) par analyse en cytométrie en flux.
6. caractérisation des hDPSCs par cytométrie en flux
- Sélectionnez stromal mésenchymateuse (CSM)-les antigènes de surface spécifiques ou neuronales.
- Culture de la hDPSCs en plaques 6 puits (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5).
- Détacher les hDPSCs à 28 jours de séparation de la pulpe dentaire ou après 14 jours de milieu de culture neuronale (étape 5.1) avec 1 mL d’EDTA-trypsine pendant 3 min à 37 ° C ou doucement un grattoir.
- ajouter 4 ml (ratio 1:5) du milieu de culture (étape 2.5) pour arrêter l’action de la trypsine et centrifuger à 259 x g pendant 6 min à température ambiante. laver l’autre 2 fois avec 2 mL de PBS à température ambiante.
- Difficulté la hDPSCs ou traités avec du paraformaldéhyde 4 % dans du PBS pendant 10 min à 4 ° C.
- Permeabilize hDPSCS avec surfactant non ionique de 0,1 % (v/v) dans du PBS supplémentaires 10 min à température ambiante.
- Effectuer le blocage avec 5 % lait écrémé en poudre dans 1 mL de PBS pendant 1 h à température ambiante.
- Laver 3 fois avec 1 mL de PBS et incuber les cellules avec anti-CD105 (1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD44 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-STRO-1 (1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD90 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-CD73 (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-β3-tubuline (au 1/100 / 5 x 105 cellules), anti-NFH (au 1/100 / 5 x 105 cellules) et anti-GAP43 (au 1/100 / 5 x 105 cellules) mAb pendant 1 h à température ambiante.
- Laver les cellules 3 fois avec 1 mL de PBS et incuber avec anti-souris PE (01:50 / 5 x 105 cellules) ou anti-lapin CY5 (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb supplémentaires 1 h à température ambiante.
- Utiliser les anticorps secondaires pour blocage des cellules immunopositifs (anti-souris PE ou anti-lapin CY5 mAb) et d’analyser tous les échantillons avec un cytomètre en flux et acquérir au moins 20 000 événements.
7. évaluation de l’Expression de la PrPC en hDPSCs par Flow Cytometry analyse
- Culture les plaques 6 puits de hDPSCsin (2 x 105 cellules/mL) avec 2 mL de milieu de culture (étape 2.5).
- Détacher des hDPSCs 21 et 28 jours de séparation de la pulpe dentaire et après 7 ou 14 jours avec milieu de culture neuronal (étape 5.1) avec 1 mL de trypsine-EDTA et arrêter l’action de la trypsine, comme indiqué au point 6.4. Difficulté les spécimens avec 4 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 10 min à 4 ° C.
- Permeabilize avec 0,1 % (v/v) non ionique surfactantin PBS pendant 10 min à RT. Retirez le surnageant et tacher les cellules avec lapin anti-PrP mAb EP1802Y (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb pendant 1 h à RT. incuber avec anti-lapin CY5 (01:50 / 5 x 105 cellules) mAb pour supplémentaire 1 h à température ambiante.
- Analyser tous les échantillons avec un cytomètre de flux et d’acquérir au moins 20 000 événements.
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Representative Results
Les procédures d’isolement et de séparation de hDPSCs de la pulpe dentaire, obtenue à partir de la troisième molaire, sont des processus complexes dans lesquels petits changements peuvent entraîner un résultat ruineux. Dans cet article, nous utilisons le protocole de Arthur et al. 12 avec plusieurs améliorations. Un schéma représentatif de procédures est illustré à la Figure 1.
hDPSCs représente une population hétérogène de cellules avec des clones distincts et les différences dans la capacité de prolifération et de différenciation7,8. Après la séparation de la pulpe et l’ensemencement de minuscules fragments de pulpe, nous avons observé des amas de cellules en expansion sur la périphérie. La figure 2 montre un petit amas de cellules à 1 jour (panneau de gauche), 4 jours (panneau central) et 7 jours (panneau de droite) de la séparation de la pulpe dentaire. Généralement, ces amas de cellules grandissent pour atteindre le confluent entre 7 et 12 jours environ.
Ces cellules, après différenciation neuronale induite par l’EGF/bFGF, réduisent leur croissance et, après deux semaines, il était possible d’observer des changements significatifs dans l’excroissance de la morphologie et les neurites des cellules (Figure 3).
Dans la Figure 4, nous démontrent que non traitées hDPSCs multipotentes mésenchymateuses stromales surface des antigènes spécifiques tels que CD44, CD90, CD105, CD73 et STRO-15,9. Dans le cas contraire, après stimuli appropriés induction neuronales, hDPSCs expriment des marqueurs neurones spécifiques telles que β3-tubuline NFH et GAP43. hDPSCs, des stimuli non traités ou traités avec induction neuronales, n’expriment pas de marqueurs hématopoïétiques tels que CD14 et CD19.
Dans la Figure 5, nous montrons que hDPSCs expriment précocement PrPC (21 et 28 jours) et, après les processus de différenciation neuronale induite par EGF/bFGF pour supplémentaire de 7 à 14 jours, le PrPC teneur accrue (Figure 5A). Étant donné que plusieurs auteurs ont indiqué que la PrPC intervient dans la différenciation cellulaire neuronale, nous avons évalué le rôle de la PrP endogèneC dans ce processus. Par conséquent, un petits ARN interférents (siARN PrP) a été appliqué pour l’ablation des PrPC et sa fonction. Un prétraitement avec siARN pendant 72 h avant des stimuli EGF/bFGF pendant 14 jours empêche l’expression de marqueurs neurones B3-tubuline et NHF (Figure 5B). Les données montrent que le silencieux d’échappement de la PrPC de siARN nui au processus de différenciation neuronale de hDPSCs, induite par l’EGF/bFGF après 2 semaines.
Figure 1 : Régime de la séparation de la pulpe dentaire de la troisième molaire. La dent a été ouvert avec un cutter par col coupe coronale parallèle et tangent à travers le toit de la chambre pulpaire et la pulpe a été doucement enlevée dans des conditions stériles avec une petite pelle et placée dans un tube à essai. La pulpe, après traitement de solution de hank, a été coupée en tranches et traitée avec la collagénase IV pendant 15 min puis propagée dans une fiole de T25. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : morphologie des hDPSCs à des jours différents de la séparation de la pulpe dentaire par microscope à contraste de phase. Morphologie des hDPSCs de la pulpe dentaire à des jours différents (1, 4, 7) de la séparation de la pulpe dentaire. Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : De hDPSCs par microscope à contraste de phase de la croissance des neurites. Morphologie des hDPSCs de soins dentaires de la pâte non traité ou traité avec EGF/bFGF pendant 14 jours. Barreaux de l’échelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : caractérisation hDPSCs. Analyse d’écoulement cytometry de CD44 CD90, CD105, CD73, STRO-1, CD14, CD19, β3-tubuline, expression NFH et GAP43 en hDPSCs non traitées ou traitées avec EGF/bFGF pendant 14 jours. Numéro de cellulaire d’histogrammes représentent journal fluorescence vs , bloqués sur une population de cellules d’une diffusion de nuages de points/avant latérale histogramme (SS/FS). Chaque panneau a été comparée avec l’anticorps secondaires correspondants comme témoin négatif. Une expérience représentative parmi 3 s’affiche. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Rôle de la PrPC au cours de la différenciation neuronale de hDSPCs. (A) analyse Cytofluorométrique d’expression de la PrPC non traitée (21 et 28 jours de séparation de la pulpe dentaire) et après des 7 et 14 jours avec les médias de l’induction neuronales EGF/bFGF. Chaque panneau a été comparée avec le réglage correspondant de négatif d’isotype IgG. Une expérience représentative parmi 3 s’affiche. Analyse par Western blot (B) des marqueurs neuronaux β3-tubuline et expression NFH (28 jours de séparation de la pulpe dentaire) et après 14jours supplémentaires avec les médias induction neuronales EGF/bFGF la présence ou l’absence de siARN PrP. Cette figure 5 (A, B) a été modifiée par « Rôle des complexes multimoléculaires de Prion protéines-EGFR durant la différenciation neuronale des humains cellules souches issues de pulpe dentaires » 23. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Dans ce travail, nous nous sommes concentrés sur les méthodes d’isolement et de la différenciation neuronale de hDPSCs ; en outre, nous avons évalué le rôle de la PrPC dans ce processus. Il y a plusieurs méthodes pour isoler et différencier hDPSCs en cellules semblables à des neurones et des étapes critiques au cours du processus. hDPSCs sont capables de se différencier en plusieurs lignées comme chondroblastes, adipocytes, ostéoblastes et neurones. Dans notre document, nous avons étudié les mécanismes de la différenciation neuronale et la présence de la PrPC. Comme indiqué plus haut, ces cellules expriment typiques mésenchymateuses antigènes de surface de stroma spécifiques tels que CD44, CD90, CD105, CD73 et STRO-110,25,26.
Dans le protocole, plusieurs étapes critiques peuvent provoquer l’échec de la procédure de séparation. La première étape critique est représentée par le choix des patients,27. Dans notre expérience, nous avons constaté que l’âge des donneurs (> 20) réduit progressivement la capacité de prolifération et la différenciation des cellules souches. Dans nos expériences, nous avons utilisé des troisièmes molaires excisés de patients âgés de 13 à 19 ans et avec aucun antécédent de consommation d’alcool ou de drogue, toutes non-fumeurs et une bonne hygiène buccale.
La deuxième étape essentielle est représentée par le choix de l’enzyme pour séparer les cellules provenant du tissu de pulpe, qui pourrait représenter la principale étape chaude du procédé de séparation de cellules souches. En fait, nous avons réalisé qu’une large utilisation de collagénase I et II, enzymes qui peuvent être trop agressifs, peut endommager les cellules présentes dans le tissu de pulpe pendant le processus de séparation. Pour cette raison, nous avons décidé d’utiliser collagénase IV parce que ce genre de collagénase comme une activité tryptique plus faible que collagénase de type I et II. En suivant exactement la procédure, il est possible d’obtenir des cellules souches dans 90 % des dents traitées.
Après la séparation, la solution contenant hDPSCs est cultivée dans des flacons appropriés jusqu'à ce que le passage de la 6° (approximativement 21 à 28 jours) pour éviter la présence de non-cellules souches dans la culture. À 28 jours, ils ont été testés pour la présence de typiques antigènes mésenchymateuses (comme décrit ci-dessus) et utilisés pour des expériences que lorsqu’ils étaient positifs. En fait, malgré les progrès réalisés tout au long de l’années sur hDPSCs, il y a tout de même important de limites représentant par l’extrême hétérogénéité de la population.
Comme indiqué par plusieurs auteurs, il y a des types de population de cellules différentes dans la pulpe dentaire et, à ce jour, il est inconnu, ce qui est les meilleurs phénotypes capables de différencier dans chaque lignée mésenchymateuse (chondroblastes, adipoblastes, ostéoblastes ou les neurones). Pour éviter les limitations actuelles de notre et d’autres procédures, la prochaine étape sera de sélectionner les populations cellulaires avec des phénotypes spécifiques à l’aide d’anticorps monoclonaux spécifiques.
Dans un travail antérieur, nous avons montré que la PrPC est exprimée de hDPSCs. En fait, il est possible d’observer une faible positivité à 21 jours et une augmentation de la teneur en PrPC à 28 jours. En outre, nous avons observé que durant l’induction neuronale EGF/bFGF-médiation, PrPC contenu augmentait encore. Par ailleurs, nous avons étudié le rôle de la PrP endogèneC dans des processus d’induction neuronales de hDPSCs. Le silence transitoire des PrPC ont empêché le processus de différenciation de l’hDPSCs induite par l’EGF/bFGF23.
Nous avons affiné et amélioré les méthodes d’isolement, de séparation et de la culture in vitro de hDPSCs avec des procédures simples et polyvalents. Ces innovations permettent d’obtenir des clones de cellules plus efficaces et l’expansion à grande échelle des cellules souches mésenchymateuses. Aussi, nous suggérons que les hDPSCs sont un excellent modèle expérimental pour l’étude des mécanismes cellulaires et moléculaires des processus de différenciation neuronale de MSCs.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par la « Fondazione Varrone » et Rieti Université Hub « Sabina Universitas » de Vincenzo Mattei.
La figure 5 (A, B) reproduit avec la permission de l’éditeur Taylor & Francis Ltd du : complexe multimoléculaire de rôle de Prion protein-EGFR durant la différenciation neuronale des humains cellules souches issues de pulpe dentaires. Mekki, S., Manganelli V., C. Santacroce, Santilli F., L. Piccoli, Sorice M. Mattei V. Prion. Le 4 mars 2018. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
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