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Developmental Biology

अलगाव, प्रचार, और मानव दंत लुगदी स्टेम कोशिकाओं के Neuronal भेदभाव के दौरान Prion प्रोटीन अभिव्यक्ति

Published: March 18, 2019 doi: 10.3791/59282
Automatic Translation
1,2, 1, 2, 1,2, 3, 3, 2, 2, 1,2
1Laboratory of Experimental Medicine and Environmental Pathology, Sabina Universitas - Rieti University Hub, 2Department of Experimental Medicine, Sapienza University of Rome, 3Department of Science Dentistry and Maxillofacial, Sapienza University of Rome

Summary

यहां हम मानव दंत पल्प स्टेम सेल अलगाव और प्रसार के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत क्रम में न्यूरोनल भेदभाव प्रक्रिया के दौरान prion प्रोटीन अभिव्यक्ति का मूल्यांकन करने के लिए ।

Abstract

भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं के हेरफेर से संबंधित Bioएथिकल मुद्दों चिकित्सा अनुसंधान के क्षेत्र में प्रगति रुकावट है । इस कारण से, यह बहुत महत्वपूर्ण है के लिए विभिंन ऊतकों से वयस्क स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए इस तरह के रूप में वसा, गर्भनाल, अस्थि मज्जा और रक्त । संभव सूत्रों के अलावा, दंत लुगदी विशेष रूप से यह bioएथिकल विचारों के संबंध में प्राप्त करने के लिए आसान है, क्योंकि दिलचस्प है । दरअसल, मानव दंत पल्प स्टेम सेल (hDPSCs) वयस्क स्टेम कोशिकाओं के एक प्रकार के न्यूरोनल की तरह कोशिकाओं में अंतर कर रहे हैं और स्वस्थ रोगियों (13-19 उम्र) के तीसरे दाढ़ से प्राप्त किया जा सकता है. विशेष रूप से, दंत लुगदी एक खुदाई के साथ हटा दिया गया था, छोटे स्लाइस में कटौती, कोलेलेनज़ चतुर्थ के साथ इलाज किया और एक फ्लास्क में सभ्य । न्यूरोनल भेदभाव को प्रेरित करने के लिए, hdpscs 2 सप्ताह के लिए egf/bfgf के साथ उत्तेजित थे । पहले, हमने दर्शाया है कि विभेद की प्रक्रिया के दौरान hDPSCs में सेलुलर प्रिऑन प्रोटीन (पीआरपीसी) की सामग्री बढ़ गई । cytofluorimetric विश्लेषण पीआरपीसी की एक प्रारंभिक अभिव्यक्ति है कि न्यूरोनल भेदभाव प्रक्रिया के बाद वृद्धि दिखाई । सिरना पीआरपी के द्वारा पीआरपीसी का अपघर्षण रोके जाने से एजीएफ/बीएफजीएफ द्वारा प्रेरित न्यूरोनल विभेशिएशन को रोका गया । इस पत्र में हम इस बात को स्पष्ट करते हैं कि जैसा कि हमने अलगाव, पृथक्करण और कई आसान प्रक्रियाओं के साथ hdpscs के विट्रो खेती विधियों में वृद्धि की है, और अधिक कुशल सेल क्लोन प्राप्त किए गए थे और बड़े पैमाने पर विस्तार मध्योतक स्टेम सेल (एमएससीएस) मनाया गया । हम यह भी बताएंगे कि कैसे, प्रोटोकॉल में विस्तृत विधियों से प्राप्त hDPSCs, एमएससीएस की न्यूरोनल विभेशन प्रक्रिया और बाद में सेलुलर और आण्विक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रायोगिक मॉडल हैं ।

Introduction

mesenchymal स्टेम सेल कई ऊतकों से अलग किया गया है, अस्थि मज्जा सहित, गर्भनाल रक्त, मानव दंत लुगदी, वसा ऊतक, और रक्त1,2,3,4,5 , 6. के रूप में कई लेखकों द्वारा रिपोर्ट, hDPSCs प्लास्टिक पालन, एक ठेठ फाइब्रोब्लास्ट की तरह morphology दिखाओ । ये अलग क्लोन और प्रफलन और फर्क क्षमता7,8में अंतर के साथ एक उच्च विषम जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करते हैं । मध्योतक स्टेम सेल (यानी CD44, CD90, CD73, CD105, स्ट्रो-1) के लिए विशिष्ट मार्कर एक्सप्रेस hdpscs, वे (जैसे CD14 और CD19) और इन विट्रो multiवंशावली भेदभाव9 में सक्षम हैं, कुछ टेम मार्कर के लिए नकारात्मक हैं 10,11.

कई लेखकों को पता चला है कि इन कोशिकाओं को अलग प्रोटोकॉल का उपयोग कर neuron की तरह कोशिकाओं में अंतर करने में सक्षम हैं, कि ngf, bfgf, विशिष्ट मीडिया और पूरक7,12के साथ संयोजन में egf के अलावा शामिल हैं । इसके अलावा, कई प्रोटीन न्यूरोनल भेदभाव प्रक्रिया के दौरान शामिल है और, इन के अलावा, कई कागजात एक प्रासंगिक भूमिका और सेलुलर prion प्रोटीन की महत्वपूर्ण अभिव्यक्ति (पीआरपीसी), दोनों भ्रूण और वयस्क स्टेम सेल13में दिखाते हैं, 14. पीआरपीसी एक बहुप्रभावी तांबे चयापचय के रूप में कोशिकाओं के अंदर विभिन्न कार्यों का प्रदर्शन करने में सक्षम अणु का प्रतिनिधित्व करता है, अपोप्टोसिस, और oxidative तनाव के लिए प्रतिरोध15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.

हमारे पिछले23पेपर में, हम hDPSCs न्यूरोनल भेदभाव की प्रक्रिया में पीआरपीसी की भूमिका की जांच की । वास्तव में, hdpscs एक्सप्रेस precociously prpसी और, न्यूरोनल भेदभाव के बाद, यह एक अतिरिक्त वृद्धि का पालन करने के लिए संभव था. अंय लेखकों स्टेम सेल के न्यूरोनल भेदभाव प्रक्रियाओं में पीआरपीसी की एक संभावित भूमिका डोडो । दरअसल, पीआरपीसी मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के न्यूरॉन्स, ओलिगोडेन्ट्रोसाइट्स, और astrocytes में भेदभाव ड्राइव24. इस अध्ययन का उद्देश्य दंत लुगदी से स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए कार्यप्रणाली पर जोर देना था, इसके विभेद की प्रक्रिया और न्यूरोनल विभेद के दौरान पीआरपीसी की भूमिका.

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Protocol

तीसरे अध्ययन में इस्तेमाल किया दाढ़ (13-19 साल पुराने) रोगियों से excised दवा या शराब की खपत, सभी गैर धूंरपान और उचित मौखिक स्वच्छता के साथ कोई पूर्व इतिहास के साथ थे । स्पष्टीकरण के दिन, विज्ञान दंत चिकित्सा विभाग में और "Sapienza" रोम विश्वविद्यालय के Maxillofacial पर, सूचित सहमति रोगियों या माता पिता से प्राप्त किया गया था । नैतिक विचारों और आचार समिति के अनुमोदन के आधार पर सूचित सहमति प्राप्त की गई थी ।

1. दांत और दंत लुगदी निष्कर्षण

  1. संरक्षण या परिवहन के लिए उपयुक्त माध्यम तैयार करना ।
    1. Dulbecco के संशोधित ईगल के मध्यम कम एकाग्रता (DMEM-एल) के साथ एल ग्लूटामिन (४९४.५ मिलीलीटर) तैयार करें ।
    2. 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) और एमफोट्रिसिन की ०.५ मिलीलीटर (०.१%).
  2. रोगी से तीसरे दाढ़ निकालें, जल्दी से यह pbs के साथ कुल्ला, मध्यम के साथ एक 15 मिलीलीटर परीक्षण ट्यूब में डाल दिया है और यह कम 2 एच में प्रयोगशाला में स्थानांतरण ।
  3. एक biohazard हुड के तहत, लुगदी कक्ष की छत के माध्यम से कोरोनल काटने पास समानांतर और स्पर्शरेखा से एक कटर के साथ दांत खोलो ।
  4. धीरे से एक छोटा सा खुदाई के साथ लुगदी को हटा दें और एक परीक्षण ट्यूब में जगह है ।
  5. PBS के साथ धो तीन बार और २,५०० x g पर सेंट्रीफ्यूज RT पर 10 मिनट के लिए ।

2. दंत लुगदी और स्टेम सेल रिलीज के प्रसंस्करण

  1. supernatant निकालें, हैंक समाधान में गोली resuspend और यह एक पेट्री डिश में जगह है । 5% सह2में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 2 एच के लिए इनसेबेट ।
  2. प्रकार चतुर्थ कोलेसेनासे समाधान की तैयारी ।
    1. DMEM-L की ०.८ मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. पिघल 1 प्रकार के चतुर्थ collagenase के ०.८ मिलीलीटर में DMEM-L और कई मिनट के लिए भंवर के मिलीग्राम ।
    3. 1 मिलीलीटर के लिए DMEM-L जोड़ें 1 मिलीग्राम/मिलीलीटर एक अंतिम एकाग्रता है ।
    4. समाधान को एक ०.२२ μM फ़िल्टर के साथ फ़िल्टर करें ।
  3. २,५०० एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा हांक समाधान निकालें 10 मिनट के लिए आरटी में और लुगदी छोटे स्लाइसें में विभाजित एक डिस्पोजेबल स्केलपेल के साथ पंहुच 1 मिमी हर एक ।
  4. एक पेट्री डिश में लुगदी स्लाइस प्लेस और 5% CO2में ३७ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए प्रकार चतुर्थ कोलेजनेज के 1 मिलीलीटर के साथ सेते ।
  5. मीडियम कल्चर की तैयारी (५०० mL).
    1. एल-ग्लूटामिन के साथ DMEM-L के ४४५ मिलीलीटर के लिए ।
    2. भ्रूण गोजातीय सीरम के ५० मिलीलीटर जोड़ें (FBS) (10%) ।
    3. 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%)
  6. सेंट्रीफ्यूज २,५०० एक्स जी पर 10 मिनट के लिए आर टी पर नमूना, supernatant हटा दें, मध्यम में गोली resuspend (चरण २.५) और संस्कृति T25 कुप्पी में स्टेम सेल के लिए विशिष्ट में ३७ डिग्री सेल्सियस में 5% CO2।

3. स्टेम सेल संस्कृति और प्रचार

  1. हर दिन संस्कृति की जांच करें और, विकास के 3 दिनों के बाद, flask के भीतर आसंन कोशिकाओं के विभिंन क्लोन निरीक्षण ।
  2. हर 3 दिन में कल्चर मीडियम चेंज करते हैं ।
  3. 7 और 12 दिनों के बीच, एक बार आसंन कोशिकाओं संगम तक पहुंच गया है, उंहें trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं का इलाज-३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए EDTA या धीरे से एक सेल खुरचने का उपयोग करके अलग ।
  4. 4 मिलीलीटर (अनुपात 1:5) संस्कृति मध्यम (चरण २.५) ट्रिप् सिन कार्रवाई को रोकने के लिए जोड़ें ।
  5. सेंट्रीफ्यूज २५९ एक्स जीपर 6 मिनट के लिए सेल निलंबन, supernatant हटाने और एक T25 कुप्पी में कोशिकाओं जगह के लिए प्रचार ।
    नोट: हर 3 दिन में कोशिकाएं संगम पर पहुंचती हैं ।
  6. संस्कृति में गैर स्टेम की तरह कोशिकाओं की उपस्थिति से बचने के लिए कोशिकाओं को 21 या 28 दिन (लगभग 6-8 अंश) तक प्रचारित करें ।
  7. ३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए trypsin के 1 मिलीलीटर-EDTA के साथ कोशिकाओं को अलग या धीरे scraping. सेंट्रीफ्यूज २५९ एक्स जीपर 6 मिनट के लिए सेल निलंबन
  8. supernatant निकालें और cytofluorimetric विश्लेषण (चरण 6) के लिए कक्षों का परीक्षण करें ।

4. सिरना द्वारा क्षणिक पीआरपीसी साइलेंसिंग

  1. संस्कृति hDPSCsin 6-अच्छी तरह से प्लेट्स (2 x 105 सेल/एमएल) के साथ 2 मिलीलीटर संस्कृति मध्यम (चरण २.५) के लिए 24 ज.
  2. दिन के बाद, सिरना पीआरपी मध्यम (४०० μL) तैयार करते हैं ।
    1. एक बाँझ परीक्षण ट्यूब करने के लिए, ३८४ μL DMEM-एल जोड़ें ।
    2. प्रत्येक प्रकार की सिरना पीआरपी के लिए 1 μl जोड़ें dmem-l 5 एनएम की एक अंतिम एकाग्रता है (4 sirna पीआरपी का इस्तेमाल किया और आपूर्तिकर्ता द्वारा सत्यापित करने के लिए एक पछाड़ना क्षमता ≥ ७०%) ।
    3. DMEM-L के लिए ट्रांसफेक्शनरीएजेंट के 12 μL जोड़ें ।
    4. भंवर मिश्रण और 10 मिनट के लिए आर टी में सेते अभिकर्मक परिसरों के गठन की अनुमति है ।
  3. प्रत्येक नमूने के लिए सिरना पीआरपी मध्यम के ४०० μL जोड़ें और ३७ डिग्री सेल्सियस पर 6 ज के लिए सेते ।
  4. सिरना पीआरपी माध्यम को त्यागने के बिना, संस्कृति माध्यम (step २.५) के १.६ मिलीलीटर (1 से 5 का अनुपात) जोड़ें ।
  5. ३७ डिग्री सेल्सियस पर ७२ h के लिए कोशिकाओं को छोड़ दें ।
  6. अधिनतांत निकालें और 3 बार धोने के साथ PBS के 2 मिलीलीटर RT पर ।
  7. 7 और/या 14 दिन (चरण ५.१) के लिए न्यूरोनल संस्कृति मध्यम के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  8. न्यूरोनल कल्चर मीडियम को हर 3 दिन में बदलें ।
    नोट: प्रत्येक बार न्यूरोनल कल्चर माध्यम को प्रतिस्थापित करने के लिए sirna prp समाधान बदलें ।
  9. समय के अंत में, टी आर टी पर pbs के 2 मिलीलीटर और पश्चिमी ब्लॉट विश्लेषण द्वारा न्यूरोनल सतह एंटीजन के लिए परीक्षण के साथ 3 बार धो लें ।

5. hDPSCs की न्यूरोनल प्रेरण प्रक्रिया

  1. न्यूरोनल कल्चर मीडियम वडा (५०० mL).
    1. ंयूरोनल कोशिकाओं को तैयार बेसल मीडिया के ४४४.७ मिलीलीटर तैयार करें ।
    2. मध्यम करने के लिए सीरम के ५० मिलीलीटर-मुक्त पूरक भ्रूण और वयस्क न्यूरोनल स्टेम कोशिकाओं की दीर्घकालिक व्यवहार्यता का समर्थन करने के लिए इस्तेमाल किया (10%) ।
    3. बुनियादी फाइब्रोब्लास्ट ग्रोथ फैक्टर (बीएफजीएफ) (अंतिम एकाग्रता ४० एनजी/एमएल) और एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF) की १०० μL मीडियम (अंतिम एकाग्रता 20 एनजी/एमएल) के २०० μL जोड़ें ।
    4. 5 मिलीलीटर पेनिसिलिन/स्ट्रेप्टोमाइसिन (1%) माध्यम से ।
  2. 6 में संस्कृति hdpscs-अच्छी तरह से प्लेट्स (2 x 105 सेल/पल्प जुदाई से 28 दिनों तक) और उंहें न्यूरोनल संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर के साथ उत्तेजित ।
  3. हर 3 दिन supernatant त्यागें, आरटी पर pbs के 2 मिलीलीटर के साथ 3 बार धोने और न्यूरोनल संस्कृति माध्यम के 2 मिलीलीटर की जगह ।
  4. 7 और/या 14 दिनों के बाद, trypsin के 1 मिलीलीटर के साथ कोशिकाओं को अलग-३७ डिग्री सेल्सियस पर 3 मिनट के लिए EDTA या एक खुर के साथ धीरे ।
  5. 4 मिलीलीटर (अनुपात 1:5) संस्कृति मध्यम (चरण २.५) ट्रिप् सिन कार्रवाई को रोकने के लिए जोड़ें ।
  6. न्यूरोनल सतह एंटीजन की उपस्थिति के लिए परीक्षण (चरण 6) या prion प्रोटीन अभिव्यक्ति (चरण 7) प्रवाह cytometry विश्लेषण द्वारा ।

6. प्रवाह Cytometry द्वारा hDPSCs के लक्षण वर्णन

  1. मध्योतक stromal (एमएससी) का चयन करें-विशिष्ट या न्यूरोनल सतह एंटीजन ।
  2. संस्कृति (चरण २.५) के 2 मिलीलीटर के साथ 6-well प्लेटों (2 x 105 सेल/एमएल) में hDPSCs ।
  3. 28 दिनों में दंत पल्प जुदाई से या के बाद 14 दिनों के न्यूरोनल संस्कृति मध्यम (चरण ५.१) के 1 मिलीलीटर trypsin के साथ-edta 3 मिनट के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस या धीरे खुर के लिए पर अलग hdpscs ।
  4. 4 मिलीलीटर (अनुपात 1:5) संस्कृति मध्यम (चरण २.५) के जोड़ें ट्रिप् सिन कार्रवाई को रोकने के लिए और 6 मिनट के लिए २५९ x g पर केंद्रापसारक rt. Wash पर pbs के 2 मिलीलीटर के साथ एक और 2 बार धो लें ।
  5. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ अनुपचारित या इलाज hDPSCs फिक्स ।
  6. आर टी पर अतिरिक्त 10 मिनट के लिए पीबीएस में ०.१% (v/v) गैर-आयनिक सर्फेक्टेंट के साथ hDPSCS को पारगम्य बनाना ।
  7. 5% के साथ अवरुद्ध प्रदर्शन नॉनफैट सूखे दूध 1 के लिए PBS के मिलीलीटर में आरटी पर 1 एच ।
  8. PBS के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धो लें और एंटी-CD105 (1:100/5 x 10 5 कोशिकाओं) , विरोधी CD44 (1:100/5 x 10 5 कोशिकाओं), एंटी-स्ट्रो-1 (1:100/5 x 10 5 कोशिकाओं), विरोधी-CD90 (1:100/5 x 10 5 कोशिकाओं), विरोधी CD73 (1:100/5 x 105 कोशिकाओं), विरोधी β3-Tubulin (1:100/5 x 105 कोशिकाओं), विरोधी nfh (1:100/5 x 105 कोशिकाओं) और विरोधी GAP43 (1:100/5 x 105 कोशिकाओं) MAB के लिए 1 ज पर आर.
  9. सेल 3 बार PBS के 1 मिलीलीटर के साथ धोने और विरोधी माउस पीई (1:50/5 x 105 कोशिकाओं) या विरोधी खरगोश CY5 (1:50/5 x 10 5 कोशिकाओं) mab के साथ अतिरिक्त 1 एच पर आरटी के लिए ।
  10. immunopositive कोशिकाओं gating (विरोधी माउस पीई या विरोधी खरगोश CY5 mAb) के लिए माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करें और एक प्रवाह cytometer के साथ सभी नमूनों का विश्लेषण और कम से २०,००० घटनाओं का अधिग्रहण ।

7. प्रवाह Cytometry विश्लेषण द्वारा hDPSCs में पीआरपीसी अभिव्यक्ति का मूल्यांकन

  1. संस्कृति (चरण २.५) के 2 मिलीलीटर के साथ hDPSCsin 6-अच्छी तरह से प्लेट्स (2 x 105 सेल/एमएल) ।
  2. 21 और 28 दिनों में दंत पल्प जुदाई से और 7 और/या न्यूरोनल संस्कृति माध्यम (चरण ५.१) के साथ 14 दिनों के बाद ट्रिप् सिन के 1 मिलीलीटर के साथ-edta और ट्रिप् सिन कार्रवाई को रोकने के रूप में कदम ६.४ में वर्णित hdpscs अलग । 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड के साथ नमूनों को ठीक करें ।
  3. आर टी में 10 मिनट के लिए ०.१% (v/v) गैर-आयनिक सर्फेक्टनहीन पीबीएस के साथ पारबराइज्ड करें । supernatant निकालें और खरगोश विरोधी पीआरपी mAb EP1802Y (1:50/5 x 105 कोशिकाओं) mab के साथ कोशिकाओं दाग एंटी-खरगोश CY5 (1:50/5 x 105 कोशिकाओं के साथ) mab के लिए आर टी पर अतिरिक्त 1 एच ।
  4. एक प्रवाह cytometer के साथ सभी नमूनों का विश्लेषण और कम से २०,००० घटनाओं का अधिग्रहण ।

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Representative Results

दंत लुगदी से hDPSCs के अलगाव और पृथक्करण प्रक्रियाओं, तीसरे दाढ़ से प्राप्त, जटिल प्रक्रियाओं जिसमें छोटे परिवर्तन एक छोटी सी परिणाम का नेतृत्व कर सकते हैं । इस पत्र में, हम आर्थर एट अल के प्रोटोकॉल का उपयोग करें। 12 कई सुधार के साथ । प्रक्रियाओं की एक प्रतिनिधि योजना चित्रा 1में दिखाया गया है ।

hdpscs विशिष्ट क्लोन और प्रफलन और फर्क क्षमता7,8में अंतर के साथ कोशिकाओं की एक विषम जनसंख्या का प्रतिनिधित्व करता है । लुगदी जुदाई और लुगदी के छोटे टुकड़ों के बोने के बाद, हम परिधि पर विस्तार कोशिकाओं के समूहों मनाया । चित्रा 2 एक दिन (बाएं पैनल), 4 दिन (केंद्रीय पैनल) और दंत लुगदी जुदाई से 7 दिनों (सही पैनल) में कोशिकाओं के एक छोटे से क्लस्टर से पता चलता है । आमतौर पर, कोशिकाओं के इन समूहों को विकसित करने के लिए लगभग 7 और 12 दिनों के बीच संगम तक पहुंचने ।

इन कोशिकाओं, egf/bfgf द्वारा प्रेरित न्यूरोनल भेदभाव के बाद, उनके विकास को कम करने और दो सप्ताह के बाद यह कोशिका आकारिकी और न्यूरोनल वृद्धि (चित्रा 3) में महत्वपूर्ण परिवर्तन का निरीक्षण करने के लिए संभव था.

चित्रा 4में, हम बताते है कि अनुपचारित hdpscs एक्सप्रेस multipotent मेसनेकाइमल stromal विशिष्ट सतह एंटीजन जैसे CD44, CD90, CD105, CD73, और स्ट्रो-1 5,9। अंयथा, उपयुक्त न्यूरोनल प्रेरण stimuli के बाद, hdpscs एक्सप्रेस विशिष्ट न्यूरोनल मार्कर जैसे β3-tubulin, nfh, और GAP43. hdpscs, अनुपचारित या न्यूरोनल प्रेरण उत्तेजकी के साथ इलाज किया, CD14 और CD19 जैसे हेमेटोपोइटिक मार्कर व्यक्त नहीं करते.

चित्रा 5में, हम बताते है कि hdpscs एक्सप्रेस precociously prpसी (21 और 28 दिन) और, के बाद न्यूरोनल भेदभाव प्रक्रिया egf/bfgf द्वारा अतिरिक्त 7 और 14 दिनों के लिए प्रेरित किया, पीआरपीसी सामग्री में वृद्धि हुई (चित्रा 5ए) । के बाद से कई लेखकों ने बताया कि पीआरपीसी सेलुलर न्यूरोनल भेदभाव में शामिल है, हम इस प्रक्रिया में अंतर्जात पीआरपीसी की भूमिका का मूल्यांकन किया । इसलिए, एक छोटा सा हस्तक्षेप आरएनए (siRNA पीआरपी) ablate पीआरपीसी और इसके समारोह के लिए लागू किया गया था । ७२ से पहले egf/bfgf उत्तेजनाओं के लिए sirna के साथ pretreatment 14 दिनों के लिए न्यूरोनल मार्कर B3-ट्यूब्युन और nhf (चित्रा 5B) की अभिव्यक्ति रोकता है । आंकड़ों से पता चलता है कि सीरना द्वारा पीआरपीसी के सिलिंग से 2 सप्ताह बाद egf/bFGF द्वारा प्रेरित hDPSCs की न्यूरोनल विभेशीकरण प्रक्रिया प्रभावित हुई ।

Figure 1
चित्रा 1 : थर्ड मोलर से डेंटल पल्प सेपरेशन की योजना । दांत लुगदी चैंबर की छत के माध्यम से कोरोनल काटने पास समानांतर और स्पर्शरेखा से एक कटर के साथ खोला गया है और लुगदी धीरे एक छोटा सा खुदाई के साथ बाँझ शर्तों के तहत हटा दिया गया था और एक परीक्षण ट्यूब में रखा गया था । लुगदी, हैंक समाधान उपचार के बाद, स्लाइस में काट दिया गया था और 15 मिनट के लिए कोलेलेनज़ चतुर्थ के साथ इलाज किया और एक T25 flask में प्रचारित । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : hdpscs आकृति विपरीत माइक्रोस्कोप द्वारा दंत लुगदी जुदाई से अलग दिनों में आकारिकी. दंत लुगदी जुदाई से अलग दिन (1, 4, 7) पर दंत लुगदी से hDPSCs की Morphology. स्केल पट्टियां = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3 : चरण विपरीत माइक्रोस्कोप द्वारा hDPSCs के Neurite वृद्धि । दंत लुगदी से hDPSCs की Morphology अनुपचारित या 14 दिनों के लिए EGF/bFGF के साथ इलाज किया । स्केल पट्टियां = १०० μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें । 

Figure 4
चित्रा 4 : Hdpscs लक्षण वर्णन । CD44, CD90, CD105, CD73, स्ट्रो-1, CD14, CD19, β3-ट्यूब्युन, NFH और GAP43 अभिव्यक्ति का प्रवाह cytometry विश्लेषण hDPSCs में अनुपचारित या 14 दिनों के लिए EGF/bFGF के साथ इलाज किया । Histograms लॉग प्रतिदीप्ति बनाम सेल नंबर, एक ओर बिखराव/आगे बिखराव (एसएस/एफएस) हिस्टोग्राम की कोशिका जनसंख्या पर gated का प्रतिनिधित्व करते हैं । प्रत्येक पैनल एक नकारात्मक नियंत्रण के रूप में इसी माध्यमिक एंटीबॉडी के साथ तुलना की गई थी । 3 के बीच एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5 : hDSPCs के न्यूरोनल विभेद के दौरान पीआरपीसी की भूमिका । (क) अनुपचारित पीआरपीसी अभिव्यक्ति का साइटोफ्लोरीमेट्रिक विश्लेषण (21 और 28 दिन दंत पल्प पृथक्करण से) और अतिरिक्त 7 और 14 दिनों के बाद न्यूरोनल इंडक्शन मीडिया Egf/bfgf के साथ । प्रत्येक पैनल इसी igg नकारात्मक समप्ररूप नियंत्रण के साथ तुलना की गई थी । 3 के बीच एक प्रतिनिधि प्रयोग दिखाया गया है । (ख) न्यूरोनल मार्कर्स Β3-ट्यूबइन और एनएफएच एक्सप्रेशन (डेंटल पल्प सेपरेशन से 28 दिन) और सिरना पीआरपी की उपस्थिति या अनुपस्थिति में न्यूरोनल इंडक्शन मीडिया egf/बीएफजीएफ के साथ अतिरिक्त 14 दिनों के बाद वेस्टर्न ब्लॉट विश्लेषण । यह आंकड़ा 5 (ए, बी) को मानव दंत लुगदी व्युत्पन्न स्टेम सेल के न्यूरोनल विभेद के दौरान Prion प्रोटीन-EGFR बहुआण्विक परिसर की भूमिका से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

इस काम में, हम अलगाव और hdpscs के न्यूरोनल भेदभाव के लिए कार्यप्रणाली पर ध्यान केंद्रित; इसके अलावा, हम इस प्रक्रिया में पीआरपीसी की भूमिका का मूल्यांकन किया । अलग करने और इस प्रक्रिया के दौरान न्यूरोऑन की तरह कोशिकाओं और महत्वपूर्ण कदम में hDPSCs अंतर करने के लिए कई तरीके हैं. hDPSCs ऐसे chondroblasts, adipocytes, osteoblasts, और ंयूरॉंस के रूप में कई प्रजातियों में अंतर करने में सक्षम हैं । हमारे अखबार में, हम न्यूरोनल भेदभाव और पीआरपीसीकी उपस्थिति के तंत्र की जांच की । जैसा कि ऊपर चर्चा की है, इन कोशिकाओं ठेठ मध्योतक stromal विशिष्ट सतह एंटीजन जैसे CD44, CD90, CD105, CD73, और स्ट्रो-110,25,26व्यक्त करते हैं ।

प्रोटोकॉल में, कई महत्वपूर्ण कदम पृथक्करण प्रक्रिया की विफलता का कारण बन सकते हैं । पहले महत्वपूर्ण कदम27रोगियों की पसंद का प्रतिनिधित्व किया है । हमारे अनुभव में, हमने पाया है कि दाताओं की बढ़ती उंर (> 20) धीरे प्रसार और स्टेम सेल के भेदभाव की क्षमता कम कर देता है । हमारे प्रयोगों में, हम तीसरे 13-19 साल की उंर के रोगियों से उत्तेजित दाढ़ का इस्तेमाल किया और नशीली दवाओं या शराब की खपत, सभी गैर धूंरपान और उचित मौखिक स्वच्छता के साथ कोई पूर्व इतिहास के साथ ।

दूसरा महत्वपूर्ण कदम एंजाइम की पसंद के द्वारा प्रतिनिधित्व करने के लिए लुगदी ऊतक से कोशिकाओं को अलग है, जो स्टेम सेल पृथक्करण प्रक्रिया के मुख्य गर्म कदम का प्रतिनिधित्व कर सकता है । वास्तव में, हमें एहसास हुआ कि कोलेज़ानेस मैं और द्वितीय का एक व्यापक उपयोग, एंजाइमों है कि बहुत आक्रामक हो सकता है, पृथक्करण प्रक्रिया के दौरान लुगदी ऊतक में मौजूद कोशिकाओं को नुकसान पहुंचा सकता है । इस कारण के लिए, हम कोलेलेनज़ चतुर्थ का उपयोग करें, क्योंकि कम tryptic गतिविधि के रूप में कोलेलेनज़ के इस तरह के रूप में मैं और द्वितीय कोलेसेनासे प्रकार का फैसला किया । ठीक प्रक्रिया के बाद, यह इलाज दांत के ९०% में स्टेम सेल प्राप्त करने के लिए संभव है ।

जुदाई के बाद, hdpscs युक्त समाधान 6 ° बीतने तक उचित बोतल में सभ्य है (approximatively 21-28 दिन) गैर की उपस्थिति से बचने के लिए संस्कृति में स्टेम कोशिकाओं. 28 दिनों में, वे ठेठ मध्योतक एंटीजन की उपस्थिति के लिए परीक्षण किया गया (ऊपर के रूप में संदर्भित) और प्रयोगों के लिए इस्तेमाल केवल जब वे सकारात्मक थे । वास्तव में, hDPSCs पर साल भर में की गई प्रगति के बावजूद, वहां अभी भी महत्वपूर्ण जनसंख्या की चरम विविधता द्वारा प्रतिनिधित्व सीमाएं हैं ।

के रूप में कई लेखकों द्वारा दिखाया गया है, दंत लुगदी में अलग सेल जनसंख्या प्रकार के होते है और तिथि करने के लिए, यह अज्ञात क्या सबसे अच्छा phenotypes प्रत्येक मध्योतक वंश में अंतर करने में सक्षम है (chondroblasts, adipoblasts, osteoblasts या ंयूरॉंस) । हमारे और अन्य प्रक्रियाओं की वर्तमान सीमाओं से बचने के लिए, अगले कदम विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग विशिष्ट phenotypes के साथ सेलुलर आबादी का चयन करने के लिए किया जाएगा.

पिछले काम में, हम पता चला कि पीआरपीसी hDPSCs से व्यक्त की है । वास्तव में, यह 21 दिनों में एक कमजोर सकारात्मकता का निरीक्षण और 28 दिनों में पीआरपीसी सामग्री की वृद्धि संभव है । इसके अलावा, हमने देखा कि egf/bfgf-mediated न्यूरोनल प्रेरण के दौरान, पीआरपीसी सामग्री आगे बढ़ाया गया था । इसके अलावा, हमने hDPSCs की न्यूरोनल इंडक्शन प्रोसेस में एंडोजेनस पीआरपीसी की भूमिका की जांच की । पीआरपीसी के क्षणिक साइलेंसिंग से ईजीएफ/बीएफजीएफ द्वारा पे्ररित एचपीएससीज की विभेद प्रक्रियाको रोका गया ।

हम सरल और बहुमुखी प्रक्रियाओं के साथ अलग-थलग, पृथक्करण और hDPSCs के विट्रो कृषि की विधियों में सुधार करते हैं । इन नवाचारों और अधिक कुशल सेल क्लोन प्राप्त करने की अनुमति और मध्योतक स्टेम सेल के बड़े पैमाने पर विस्तार । इसके अलावा, हमारा सुझाव है कि hDPSCs एमएससीएस न्यूरोनल विभेदन प्रक्रिया के सेलुलर और आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट प्रायोगिक मॉडल हैं ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के द्वारा समर्थित किया गया था "Fondazione वार्षिन" और Rieti विश्वविद्यालय हब "सबीना विश्विद्यालय" को Vincenzo Mattei.

चित्र 5 (A, B) प्रकाशक टेलर & फ्रांसिस लिमिटेड की अनुमति से पुनर्मुद्रित: मानव दंत लुगदी व्युत्पन्न स्टेम कोशिकाओं के न्यूरोनल भेदभाव के दौरान prion प्रोटीन की भूमिका-egfr बहुआण्विक परिसर । मार्टेलुची, एस., मैंगनेल्ली वी., Santacroce सी., सैंटिल्लि एफ, पिकोली एल, सोरिस एम., Mattei वी. Prion. २०१८ मार्च 4. टेलर & फ्रांसिस लिमिटेड

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amphotericin B solution Sigma-Aldrich A2942 It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce
Anti-B3tubulin Cell Signaling Technology  #4466 One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system
Anti-CD105  BD Biosciences 611314 Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail
Anti-CD44 Millipore CBL154-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-CD73  Cell Signaling Technology  13160 CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides
Anti-CD90 Millipore CBL415-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
Anti-GAP43  Cell Signaling Technology  #8945 Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity
Anti-mouse PE  Abcam ab7003 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-NFH  Cell Signaling Technology  #2836 Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein
Anti-PrP mAb EP1802Y  Abcam ab52604 Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP
Anti-rabbit CY5  Abcam ab6564 Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis
Anti-STRO 1 Millipore MAB4315-20ul Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells
B27 Supp XF CTS Gibco by life technologies A14867-01 B-27  can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture
BD Accuri C6 flow cytometer  BD Biosciences AC6531180187 Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm)
BD Accuri C6 Software  BD Biosciences Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results
bFGF PeproThec, DBA 100-18B basic Fibroblast Growth Factor 
Centrifuge CL30R Termo fisher Scientific 11210908 it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density
CO2 Incubator 3541 Termo fisher Scientific 317527-185 it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures
Collagenase, type IV  Life Technologies 17104019 Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen
Disposable scalpel  Swann-Morton 501 It is use to cut tissues
DMEM-L Euroclone ECM0060L Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate
EGF PeproThec, DBA AF-100-15 Epidermal Growth Factor 
Fetal Bovine Serum Gibco by life technologies 10270-106 FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems
Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter Sarstedt 831,823,101 it is a device that is used for filtration of solutions
Flexitube GeneSolution for PRNP Qiagen GS5621 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA  N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA  N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA  N.4  CAGTGACTATGAGGACCGTTA
Hank's solution 1x Gibco by life technologies 240200083 The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells
HiPerFect Transfection Reagent  Qiagen 301705 HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations
Neurobasal A  Gibco by life technologies 10888022 Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons 
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich 30525-89-4 Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures
penicillin/streptomycin  Euroclone ECB3001D  It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination
Phosphate buffered saline  (PBS) Euroclone ECB4004LX10  PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range
TC-Platte 6 well, Cell+,F Sarstedt 833,920,300 It is a growth surface for adherent cells
Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap Sarstedt 833,910,302 Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag
Triton X-100  Sigma-Aldrich 9002-93-1 Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions
Trypsin-EDTA  Euroclone ECB3052D  Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface
Tube Sarstedt 62,554,502 Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP
VBH 36 C2 Compact Steril ST-003009000 Offers totally protection for the enviroment and worker
ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope Zeiss 3849000962 ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods.

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References

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विकासात्मक जीव विज्ञान अंक १४५ दंत लुगदी वयस्क स्टेम सेल मध्योतक स्टेम सेल भेदभाव की प्रक्रिया prion प्रोटीन prion ।
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Martellucci, S., Santacroce, C., Manganelli, V., Santilli, F., Piccoli, L., Cassetta, M., Misasi, R., Sorice, M., Mattei, V. Isolation, Propagation, and Prion Protein Expression During Neuronal Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells. J. Vis. Exp. (145), e59282, doi:10.3791/59282 (2019).

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