Summary
Burada insan diş Pulp kök hücre izolasyon ve yayılması için bir protokol Nöronal Farklılaşma süreci sırasında prion protein ifade değerlendirmek için mevcut.
Abstract
Embriyonik kök hücre manipülasyon ilgili Biyoetik sorunları tıbbi araştırma alanındaki gelişmeler engelliyordu. Bu nedenle, farklı dokuların yağ, göbek kordonu, kemik iliği ve kan gibi yetişkin kök hücre elde etmek çok önemlidir. Biyoetik konuları ile ilgili olarak elde etmek kolaydır çünkü olası kaynaklar arasında diş pulp özellikle ilginçtir. Nitekim, insan diş Pulp kök hücreleri (hDPSCs) erişkin kök hücreleri nöronal benzeri hücrelerde ayırt etmek güçlü bir türüdür ve sağlıklı hastalar (13-19 yaş) üçüncü molar elde edilebilir. Özellikle, diş hamuru bir ekskavatör ile kaldırıldı, küçük dilimler halinde kesip, IV collagenase ile tedavi ve bir şişeye kültürlü. Nöronal Farklılaşma ikna etmek için hDPSCs 2 hafta boyunca EGF/bFGF ile teşvik. Daha önce ayırt etme işlemi sırasında Protein hDPSCs (PrPC) hücresel prion içeriğini artış göstermiştir. Cytofluorimetric analiz artmış Nöronal Farklılaşma süreci sonrasında PrPC erken ifadesi gösterdi. PrPC ablasyon siRNA tarafından PrP Nöronal Farklılaşma EGF/bFGF tarafından indüklenen engelledi. Bu yazıda, biz gibi biz yalıtım, ayrılık ve vitro yetiştirme yöntemleri hDPSCs birkaç kolay yordamlar ile gelişmiş, daha verimli Hücre klonlar Mezenkimal kök hücrelerin (MSCs) elde edilen ve büyük ölçekli genişleme olduğunu göstermek gözlenmiştir. Biz de nasıl iletişim kuralında, ayrıntılı yöntemleri ile elde edilen hDPSCs, MSCs Nöronal Farklılaşma süreci ve sonraki hücresel ve moleküler eğitim için mükemmel bir deneysel model olduğunu göster.
Introduction
Mezenkimal kök hücrelerin kemik iliği, göbek kordon kanı, insan diş pulp, yağ dokusu ve kan1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere birkaç dokulardan izole edilmiştir , 6. çeşitli yazarlar tarafından bildirildiği gibi hDPSCs plastik bağlılık, tipik bir fibroblast benzeri Morfoloji göster. Bunlar farklı klonlar ve proliferatif ve farklılaştırıcı kapasitesi7,8farklılıkları ile son derece heterojen bir nüfusu temsil etmektedir. hDPSCs hızlı Mezenkimal Kök hücre (yani CD44, CD90, CD73, CD105, STRO-1) için belirli işaretleri, onlar bazı hematopoetik işaretleri (örneğin CD14 ve CD19) negatif ve yeteneğine sahip tüp bebek multilineage farklılaşma9/, 10,11.
Birden çok yazar bu hücreler NGF, bFGF, EGF12belirli medya ve takviyeleri7,ile birlikte ek içeren farklı protokolleri kullanarak nöron benzeri hücrelerine ayırt etmek mümkün olduğunu göstermiştir. Ayrıca, birçok protein Nöronal Farklılaşma işlemi sırasında söz konusu ve bunlar arasında bir ilgili rolü ve önemli ifade hücresel prion protein (PrPC), embriyonik ve yetişkin kök hücreleri13, her ikisi de birkaç belgelerini göster 14. PrPC temsil eden bir pleiotropic molekül hücrelere farklı işlevler bakır metabolizması, Apoptozis, sahip ve direnç oksidatif stres15,16,17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22.
Bizim önceki kağıt23' te, biz PrPC hDPSCs Nöronal Farklılaşma sürecindeki rolü araştırdık. Aslında, hDPSCs tanımışlar PrPC hızlı ve Nöronal Farklılaşma sonra ek artış gözlemlemek mümkün. Diğer yazarlar PrPC kök hücrelerin Nöronal Farklılaşma süreçlerde olası bir rol olan. Nitekim, PrPC insan embriyonik kök hücre farklılaşma nöronlar, oligodendrocytes ve astrocytes24götürmek. Bu çalışmada kök hücre diş pulp, onun farklılaşma süreci ve PrPC rolünü Nöronal Farklılaşma sırasında elde etmek için metodoloji vurgulamak oldu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Üçüncü büyük azı dişleri çalışmada kullanılan hastalarda (13-19 yaş arası) uyuşturucu ya da alkol tüketimi önceki öyküsü, tüm sigara ve uygun ağız hijyeni ile eksize. Açıklama, bilim diş hekimliği bölümü ve "Sapienza" Roma Üniversitesi, Maxillofacial gününde aydınlatılmış onam hastalar veya veliler elde edildi. Aydınlatılmış onam dayalı etik kaygılar ve Etik Kurulu onayı alındı.
1. diş ve diş Pulp çıkarma
-
Koruma veya ulaşım için uygun ortamı hazırlanması.
- Dulbecco'nın modifiye kartal orta düşük konsantrasyon glikoz (DMEM-L) L-glutamin (494.5 mL) ile hazırlayın.
- 5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin ve Amfoterisin (% 0,1) 0.5 mL.
- Üçüncü molar hasta--dan hulâsa, hızlı bir şekilde PBS ile durulayın, orta ile 15 mL tüp bebek koymak ve az 2 h laboratuvarda aktarmak.
- Biohazard başlık altında dişin koronal kesme pass paralel ve teğet hamuru oda tavana bir kesici ile açın.
- Yavaşça hamuru ile küçük bir ekskavatör çıkarın ve bir test tüpü yerleştirin.
- PBS ile üç kez yıkayın ve 2500 x g 10 dk RT. az için santrifüj kapasitesi
2. diş Pulp ve kök hücre yayın işleme
- Süpernatant çıkarın, pelet Hank'in çözümde resuspend ve bir Petri kabına yerleştirin. %5 CO237 ° C'de 2 h için kuluçkaya.
-
IV collagenase eriyik hazırlığı yazın.
- DMEM-L. 0.8 mL hazırlamak
- Türü IV collagenase DMEM-L ve birkaç dakika için girdap 0.8 ml 1 mg eritebilir.
- DMEM-L eklemek son bir konsantrasyon olması 1 mL 1 mg/mL.
- Çözüm 0,22 µM filtre ile filtre.
- Hank'in çözüm Santrifüjü 2500 x g RT, 10 min için de kaldırmak ve hamuru küçük dilimler halinde approximatively 1 mm her biri tek kullanımlık bir neşter ile ayırın.
- Hamuru dilimleri bir petri kabına yerleştirin ve tip IV collagenase %5 CO237 ° C'de 15 dakika 1 mL ile kuluçkaya.
-
Orta kültür hazırlama (500 mL).
- DMEM-l L-glutamin ile 445 mL için.
- 50 mL Fetal sığır Serum (FBS) (%10) ekleyin.
- 5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin.
- 2500 x g RT, 10 dk da örneğine santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak, pelet orta (Adım 2,5) ve T25 şişesi kök hücre için belirli kültüründe % 5 CO237 ° C'de resuspend.
3. kök hücre kültür ve yayılma
- Her gün kültür denetleyin ve büyüme 3 gün sonra balonun içindeki yapışık hücreleri farklı klonlar gözlemlemek.
- 3 günde kültür orta değiştirin.
- Yapışık hücreleri ulaşmak izdiham sonra 7 ve 12 gün arasında onları tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° c için 1 mL hücrelerle tedavi veya hafifçe bir hücre kazıyıcı kullanarak ayırabilirsiniz.
- 4 ml (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin.
- Hücre süspansiyon için 259 x gde 6 dk santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve hücreleri yaymak için bir T25 şişeye koyun.
Not: 3 günde hücreleri izdiham ulaşmak. - Hücreleri olmayan kök hücreler kültür gibi varlığı önlemek için 21-28 gün (yaklaşık 6-8 pasajlar) kadar yaymak.
- Tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° C veya hafifçe kazıma için 1 mL hücrelerle bağlantısını kesin. Hücre süspansiyon için 259 x gde 6 dk santrifüj kapasitesi.
- Süpernatant kaldırmak ve test hücreleri cytofluorimetric analizi (adım 6) için.
4. geçici PrPC Silencing siRNA tarafından
- Kültür orta (Adım 2.5) için 24 h 2 mL ile hDPSCsin 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür.
-
Bir gün sonra siRNA PrP orta (400 µL) hazırlayın.
- Steril tüp bebek için 384 µL eklemek DMEM-L.
- DMEM-L için 5 son bir konsantrasyon olması siRNA PrP her türü için 1 µL eklemek nM (PrP kullanılan ve devirme verimlilik ≥70% güvence altına almak için tedarikçi tarafından doğrulanmadı 4 siRNA).
- Transfectionreagent 12 µL DMEM-L. için ekleyin
- Girdap karışımı ve RT transfection kompleksleri oluşumu izin vermek için 10 min için kuluçkaya.
- Her örnek için 400 μL siRNA PrP orta ekleyin ve 37 ° C'de 6 h için kuluçkaya
- SiRNA PrP orta atarak olmadan, 1.6 mL (1-5 oranında) kültür orta (Adım 2.5) ekleyin.
- 37 ° C'de 72 h için hücre bıraktığınızdan
- Süpernatant kaldırmak ve 3 kez PBS RT., 2 mL ile yıkayın
- Nöronal kültür orta 2 mL 7/veya 14 gün (Adım 5.1) ekleyin.
- Nöronal kültür orta 3 günde değiştirin.
Not: SiRNA PrP çözüm her zaman değiştir nöronal kültür orta yerine. - Zaman sonunda, 3 kez PBS RT, 2 mL ile yıkama ve nöronal yüzey antijenleri için Western Blot analizi ile test.
5. nöronal indüksiyon sürecinin hDPSCs
-
Nöronal kültür orta hazırlık (500 mL).
- Bazal medya için nöronal hücre formüle 444.7 mL hazırlayın.
- Orta olarak embriyonik ve yetişkin nöron kök hücreleri (% 10) uzun vadeli canlılığı desteklemek için kullanılan serum ücretsiz ek 50 mL ekleyin.
- 200 µL temel Fibroblast büyüme faktörü (bFGF) (son konsantrasyonu 40 ng/mL) ve 100 µL Epidermal büyüme faktörü (EGF), orta (son konsantrasyonu 20 ng/mL) ekleyin.
- 5 mL penisilin/streptomisin (% 1) ekleyin Orta olarak.
- 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür hDPSCs için 28 gün hamuru ayrılması ve onları nöronal kültür orta 2 mL ile teşvik.
- 3 günde süpernatant atmak, 3 kez PBS RT, 2 mL ile yıkayın ve 2 mL nöronal kültür orta yerine.
- 7 ve/veya 14 gün sonra hücreleri tripsin-EDTA 3 dk. 37 ° c için 1 mL veya hafifçe bir kazıyıcı ile bağlantısını kesin.
- 4 mL (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin.
- Nöronal yüzey antijenleri (adım 6) varlığı veya prion protein deyim (7. adım) için Akış Sitometresi Analizi ile test.
6. hDPSCs Akış Sitometresi tarafından karakterizasyonu
- Mezenkimal stromal (MSC) seçin-özel veya nöronal yüzey antijenleri.
- 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) 2 mL kültür orta (Adım 2.5) ile hDPSCs kültür.
- HDPSCs, 28 gün diş pulp ayrılması veya 3 dk. 37 ° C veya hafifçe kazıyıcı için 1 mL tripsin-EDTA ile nöronal kültür ortamının (Adım 5.1) 14 gün sonra bağlantısını kesin.
- 4 ml (oranı 1:5) kültür tripsin eylemi durdurmak için orta (Adım 2.5) ekleyin ve centrifugate 259 x g 6 dk RT. az için yıkama başka bir PBS 2 mL ile 2 kez RT.
- Tedavi edilmemiş veya tedavi hDPSCs 4 ° C'de 10 dakika için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile saptamak
- HDPSCS %0,1 (v/v) iyonik olmayan yüzey aktif PBS içinde RT., ek 10 dk ile permeabilize
- PBS 1 ml RT. 1 h için %5 yağsız kuru süt ile engelleme gerçekleştirmek
- Yıkama PBS ile 3 kez 1 mL ve anti-CD105 hücrelerle kuluçkaya (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD44 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-STRO-1 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD90 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-CD73 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), β3-tübülin anti (1: 100 / 5 x 105 hücreleri), anti-NFH (1: 100 / 5 x 105 hücreleri) ve anti-GAP43 (1: 100 / 5 x 105 hücreleri) mAb RT. 1 h için
- 3 kez PBS 1 mL içeren hücreleri yıkama ve anti-fare PE (1:50 / 5 x 105 hücreleri) veya anti-tavşan CY5 ile kuluçkaya (1:50 / 5 x 105 hücreleri) mAb RT. ek 1 h için
- İkincil antikorlar (Anti-fare PE ya da anti-tavşan CY5 mAb) immunopositive hücreleri geçişi için kullanın ve bir Akış Sitometresi ile tüm örneklerini analiz ve en az 20.000 olaylar elde etmek.
7. hDPSCs Akış Sitometresi Analizi tarafından ifadede PrPC değerlendirilmesi
- Kültür orta (Adım 2.5) 2 mL ile hDPSCsin 6-şey plaka (2 x 105 hücre/mL) kültür.
- HDPSCs at 21 ve 28 gün diş pulp ayrılması ve nöronal kültür orta (Adım 5.1) ile 1 mL tripsin-EDTA ile 7 ve/veya 14 gün sonra bağlantısını kesin ve tripsin eylem 6.4 adımda anlatıldığı gibi durdurun. Numune 4 ° C'de 10 dakika için PBS içinde %4 paraformaldehyde ile saptamak
- %0,1 (v/v) non-iyonik surfactantin PBS 10 dakika dik kaldır at ile süpernatant permeabilize ve tavşan anti-PrP mAb EP1802Y hücrelerle (1:50 / 5 x 105 hücreleri) leke mAb Anti-tavşan CY5 ile dik Incubate (1:50 / 5 x 105 hücreleri), 1 h için mAb için RT ek 1 h
- Akış Sitometresi ile tüm örneklerini ve en az 20.000 olaylar elde etmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HDPSCs gelen diş pulp, üçüncü molar elde edilen yalıtım ve ayrımı prosedürleri küçük değişiklikler yıkıcı bir sonuç açabilir karmaşık işlemlerdir. Bu yazıda, Arthur ve diğerleri. iletişim kuralı kullanın 12 birkaç yenilik. Yordamlar temsilcisi düzeninin şekil 1' de gösterilen.
hDPSCs hücreleri farklı klonlar ve proliferatif ve farklılaştırıcı kapasitesi7,8farklılıkları türdeş olmayan bir nüfusu temsil eder. Hamuru ayırma ve hamuru küçük parçaları tohum sonra biz çevre üzerinde genişleyen hücre kümeleri gözlenen. Şekil 2 bir küçük küme hücre 1 gün (sol kapı aynası), 4 gün (merkezi paneli) ve 7 gün (doğru kapı aynası) diş pulp ayrılması gösterir. Genel olarak, bu kümeler hücre yaklaşık 7 ve 12 gün arasında izdiham ulaşmak için büyü artık.
Bu hücreler, onların büyüme Nöronal Farklılaşma EGF/bFGF tarafından indüklenen sonra azaltmak ve iki hafta sonra hücre morfolojisi ve neurites çıkıntı (şekil 3) önemli değişiklikler gözlemlemek mümkün.
Şekil 4' te, tedavi edilmezse hDPSCs multipotent Mezenkimal stromal belirli yüzey antijenleri CD44, CD90, CD105, CD73 ve vuruş-15,9gibi hızlı göster. Aksi takdirde, uygun nöronal indüksiyon uyaranlara sonra hDPSCs β3-tübülin, NFH ve GAP43 gibi belirli nöronal işaretleri hızlı. hDPSCs, tedavi edilmemiş veya tedavi ile nöronal indüksiyon uyaranlara, CD14 ve CD19 gibi hematopoetik işaretleri ifade değil.
Şekil 5' te, hDPSCs tanımışlar PrPC (21 ve 28 gün) hızlı ve ek 7 ve 14 gün boyunca EGF/bFGF tarafından indüklenen Nöronal Farklılaşma işleminden sonra PrPC içerik artan (şekil 5A) göster. Birden çok yazar PrPC hücresel Nöronal Farklılaşma ilgilenmektedir bildirdi, biz endojen PrPC bu süreçte rol değerlendirilen. Bu nedenle, küçük bir müdahale RNA (siRNA PrP) PrPC ve işlev ablate uygulandı. Önarıtma siRNA EGF/bFGF uyaranlara için 14 gün önce 72 h ile ifade nöronal işaretleri B3-tübülin ve NHF (şekil 5B) engeller. PrPC siRNA tarafından susturmak hDPSCs, 2 hafta sonra EGF/bFGF tarafından indüklenen Nöronal Farklılaşma süreci etkilenen verileri göstermek.
Resim 1 : Üçüncü molar diş pulp ayrılma düzenini. Dişin koronal kesme pass paralel ve teğet hamuru oda tavana tarafından bir kesici ile açılmış ve hamuru yavaşça küçük ekskavatör ile steril koşullarda kaldırıldı ve bir test tüpü içinde. Hank'in çözüm tedavi sonra hamuru dilimler halinde kesin ve collagenase IV 15 dakika ile tedavi ve bir T25 şişeye yayılır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : hDPSCs Morfoloji faz kontrast mikroskop tarafından diş pulp ayrılması farklı gün. HDPSCs diş pulp ayrılması farklı günlerde (1, 4, 7), diş pulp üzerinden morfolojisi. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : HDPSCs faz kontrast mikroskop tarafından akıbet Neurite. HDPSCs diş üzerinden morfolojisi 14 gün boyunca tedavi edilmemiş veya tedavi ile EGF/bFGF hamuru. Ölçek çubukları 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : hDPSCs karakterizasyonu. Akış Sitometresi Analizi CD44, CD90, CD105, CD73, vuruş-1, CD14, CD19, β3-tübülin, tedavi edilmediği veya EGF/bFGF ile 14 gün boyunca tedavi hDPSCs NFH ve GAP43 ifadede. Çubuk grafikler temsil günlük Floresans vs cep numarası, geçişli bir yan ileri/dağılım dağılım hücre nüfusu (SS/FS) çubuk grafik. Her panel ile ilgili ikincil antikorlar negatif bir denetim olarak karşılaştırıldı. Temsil edici bir deney 3 arasında gösterilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5 : PrPC hDSPCs Nöronal Farklılaşma sırasında rolünün. (A)Cytofluorimetric analiz PrPC ifade tedavi edilmezse (21 ve 28 gün diş pulp ayrılması) ve nöronal indüksiyon medya EGF/bFGF ile ek 7 ve 14 gün sonra. Her panel karşılık gelen IgG negatif izotip kontrol ile karşılaştırıldı. Temsil edici bir deney 3 arasında gösterilir. (B) Western blot analizi nöronal işaretleri β3-tübülin ve NFH ifade (diş pulp ayrılması 28 gün) ve nöronal indüksiyon media EGF/bFGF varlığı ya da yokluğu siRNA PrP ile ek 14 gün sonra. Bu rakam 5 (A, B) "Prion protein-EGFR multimolecular karmaşık insan diş hamuru elde edilen kök hücreleri Nöronal Farklılaşma sırasında rolü" 23. modifiye Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu çalışmada, yalıtım ve hDPSCs Nöronal Farklılaşma için metodoloji üzerinde duruldu; Ayrıca, PrPC bu süreçte rol değerlendirildi. Yalıtmak ve hDPSCs nöron benzeri hücreler ve kritik adımları işlemi sırasında ayırt etmek için birkaç yöntem vardır. hDPSCs chondroblasts, adipositler, dokusunu ve sinir hücreleri gibi birkaç soy ayırt edebiliyoruz. Bizim gazetede Nöronal Farklılaşma mekanizmaları ve PrPCvarlığı araştırıldı. Yukarıda da açıklandığı gibi bu hücreler CD44, CD90, CD105, CD73 ve vuruş-110,25,26gibi tipik Mezenkimal stromal özgü yüzey antijenleri hızlı.
İletişim kuralında, birkaç önemli adımlar ayrılık yordamı başarısız olmasına neden olabilir. İlk kritik adım hastalar27seçimi ile temsil edilir. Deneyim, bu artan yaş bağış bulduk (> 20) yavaş yavaş yayılmasını önleme özelliği ve kök hücre farklılaşma azaltır. Bizim deneyler, biz eski 13-19 yaş arası hastalarda ve uyuşturucu ya da alkol tüketimi önceki öyküsü, tüm sigara ve uygun ağız hijyeni ile eksize üçüncü büyük azı dişleri kullanılır.
İkinci önemli adım hücreleri kök hücreleri ayırma yordamı ana sıcak adım doğurabilecek hamuru dokusundan ayırmak için seçtiğiniz bir enzim tarafından temsil edilir. Aslında, biz fark geniş bir collagenase ı ve II, çok saldırgan olabilir enzimler kullanın hamuru dokuda mevcut hücreleri ayırma işlemi sırasında zarar verebilir. Bu nedenle, bu tür collagenase daha alt tryptic etkinlik olarak collagenase yazın çünkü ı ve II collagenase IV kullanmaya karar verdi. Tam olarak yordamı izleyerek, tedavi diş yüzde 90'ını kök hücre elde etmek mümkündür.
Boşanmadan sonra sigara-kök hücre kültür varlığı önlemek için 6 ° geçiş (approximatively 21-28 gün) kadar uygun şişeler içinde hDPSCs içeren çözüm kültürlü. 28 gün onlar tipik Mezenkimal antijenleri (olarak yukarıda başvurulan) varlığı için test ve yalnızca pozitif olduklarını deneyler için kullanılan. Aslında, hDPSCs yıl boyunca ilerlemeye rağmen sınırlamalar tarafından nüfusun heterojen aşırı temsil hala önemli vardır.
Çeşitli yazarlar tarafından gösterildiği gibi farklı hücre popülasyon türü vardır diş hamuru ve bugüne kadar sahip en iyi fenotipleri her Mezenkimal lineage (chondroblasts, adipoblasts, dokusunu veya nöronlar) ayırt etmek mümkün nedir bilinmiyor. Bizim ve diğer yordamlar mevcut kısıtlamaları önlemek için hücresel nüfus belirli fenotipleri belirli monoklonal antikorları kullanarak seçmek için sonraki adım olacaktır.
Önceki çalışmalarda, PrPC hDPSCs ifade edilir gösterdi. Aslında, bir zayıf pozitif 21 gün ve PrPC içeriği bir artış, 28 gün gözlemlemek mümkündür. Ayrıca, biz gözlenen EGF/bFGF-aracılı nöronal indüksiyon sırasında PrPC içerik daha da arttı. Ayrıca, biz endojen PrPC hDPSCs nöronal indüksiyon süreçte rol araştırdık. PrPC geçici susturmak EGF/bFGF23tarafından indüklenen hDPSCs farklılaşma süreci engelledi.
Biz ince ayar ve yalıtım, ayrılık ve hDPSCs basit ve çok yönlü yordamlar ile tüp bebek ekimi yöntemleri geliştirilmiş. Bu yenilikler daha verimli Hücre klonlar ve Mezenkimal kök hücrelerin büyük ölçekli genişleme edinme izin. Ayrıca, hDPSCs hücresel ve moleküler mekanizmaları MSCs Nöronal Farklılaşma süreci için eğitim için mükemmel bir deneysel model olduğunu göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser "Fondazione Varrone" ve Rieti Üniversitesi Hub Vincenzo Mattei için "Sabina Universitas" tarafından desteklendi.
Şekil 5 (A, B) Taylor & Francis Ltd yayımcı izni ile yayımlanmaktadır: rol Prion protein-EGFR multimolecular karmaşık insan diş hamuru elde edilen kök hücreleri Nöronal Farklılaşma sırasında. Martellucci, S., Manganelli V., Santacroce C., Santilli F., Piccoli L., Sorice M., Mattei V. deli dana. 2018 4 Mart. Taylor & Francis Ltd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amphotericin B solution | Sigma-Aldrich | A2942 | It is use to supplement cell culture media, it is a polyene antifungal antibiotic from Streptomyce |
| Anti-B3tubulin | Cell Signaling Technology | #4466 | One of six B-tubulin isoform, it is expressed highly during fetal and postnatal development, remaining high in the peripheral nervous system |
| Anti-CD105 | BD Biosciences | 611314 | Endoglin (CD105), a major glycoprotein of human vascular endothelium, is a type I integral membrane protein with a large extracellular region, a hydrophobic transmembrane region, and a short cytoplasmic tail |
| Anti-CD44 | Millipore | CBL154-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-CD73 | Cell Signaling Technology | 13160 | CD73 is a 70 kDa glycosyl phosphatidylinositol-anchored, membrane-bound glycoprotein that catalyzes the hydrolysis of extracellular nucleoside monophosphates into bioactive nucleosides |
| Anti-CD90 | Millipore | CBL415-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| Anti-GAP43 | Cell Signaling Technology | #8945 | Is a nervous system specific, growth-associated protein in growth cones and areas of high plasticity |
| Anti-mouse PE | Abcam | ab7003 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-NFH | Cell Signaling Technology | #2836 | Is an antibody that detects endogenous levels of total Neurofilament-H protein |
| Anti-PrP mAb EP1802Y | Abcam | ab52604 | Rabbit monoclonal [EP 1802Y] to Prion protein PrP |
| Anti-rabbit CY5 | Abcam | ab6564 | Is an antibody used in in flow cytometry or FACS analysis |
| Anti-STRO 1 | Millipore | MAB4315-20ul | Positive cell markers antibodies directed against mesenchymal stem cells |
| B27 Supp XF CTS | Gibco by life technologies | A14867-01 | B-27 can be used to support induction of human neural stem cells (hNSCs) from pluripotent stem cells (PSCs), expansion of hNSCs, differentiation of hNSCs, and maintenance of mature differentiated neurons in culture |
| BD Accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | AC6531180187 | Flow cytometer equipped with a blue laser (488 nm) and a red laser (640 nm) |
| BD Accuri C6 Software | BD Biosciences | Controls the BD Accuri C6 flow cytometer system in order to acquire data, generate statistics, and analyze results | |
| bFGF | PeproThec, DBA | 100-18B | basic Fibroblast Growth Factor |
| Centrifuge CL30R | Termo fisher Scientific | 11210908 | it is a device that is used for the separation of fluids,gas or liquid, based on density |
| CO2 Incubator 3541 | Termo fisher Scientific | 317527-185 | it ensures optimal and reproducible growth conditions for cell cultures |
| Collagenase, type IV | Life Technologies | 17104019 | Collagenase is a protease that cleaves the bond between a neutral amino acid (X) and glycine in the sequence Pro-X-Glyc-Pro, which is found with high frequency in collagen |
| Disposable scalpel | Swann-Morton | 501 | It is use to cut tissues |
| DMEM-L | Euroclone | ECM0060L | Dulbecco's Modified Eagle's Medium Low Glucose with L-Glutamine with Sodium Pyruvate |
| EGF | PeproThec, DBA | AF-100-15 | Epidermal Growth Factor |
| Fetal Bovine Serum | Gibco by life technologies | 10270-106 | FBS is a popular media supplement because it provides a wide array of functions in cell culture. FBS delivers nutrients, growth and attachment factors and protects cells from oxidative damage and apoptosis by mechanisms that are difficult to reproduce in serum-free media (SFM) systems |
| Filtropur BT50 0.2,500 mL Bottle top filter | Sarstedt | 831,823,101 | it is a device that is used for filtration of solutions |
| Flexitube GeneSolution for PRNP | Qiagen | GS5621 | 4 siRNAs for Entrez gene 5621. Target sequence N.1 TAGAGATTTCATAGCTATTTA N.2 CAGCAAATAACCATTGGTTAA N.3. CTGAATCGTTTCATGTAAGAA N.4 CAGTGACTATGAGGACCGTTA |
| Hank's solution 1x | Gibco by life technologies | 240200083 | The essential function of Hanks′ Balanced Salt solution is to maintain pH as well as osmotic balance. It also provides water and essential inorganic ions to cells |
| HiPerFect Transfection Reagent | Qiagen | 301705 | HiPerFect Transfection Reagent is a unique blend of cationic and neutral lipids that enables effective siRNA uptake and efficient release of siRNA inside cells, resulting in high gene knockdown even when using low siRNA concentrations |
| Neurobasal A | Gibco by life technologies | 10888022 | Neurobasal-A Medium is a basal medium designed for long-term maintenance and maturation of pure post-natal and adult brain neurons |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Paraformaldehyde has been used for fixing of cells and tissue sections during staining procedures |
| penicillin/streptomycin | Euroclone | ECB3001D | It is use to supplement cell culture media to control bacterial contamination |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Euroclone | ECB4004LX10 | PBS is a balanced salt solution used for the handling and culturing of mammalian cells. PBS is used to to irrigate, wash, and dilute mammalian cells. Phosphate buffering maintains the pH in the physiological range |
| TC-Platte 6 well, Cell+,F | Sarstedt | 833,920,300 | It is a growth surface for adherent cells |
| Tissue culture flask T-25,Cell+,Vented Cap | Sarstedt | 833,910,302 | Tissue culture flask T-25, polystyrene, Cell+ growth surface for sensitive adherent cells, e.g. primary cells, canted neck, ventilation cap, yellow, sterile, Pyrogen-free, non-cytotoxic, 10 pcs./bag |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | Widely used non-ionic surfactant for recovery of membrane components under mild non-denaturing conditions |
| Trypsin-EDTA | Euroclone | ECB3052D | Trypsin will cleave peptides on the C-terminal side of lysine and arginine amino acid residues. Trypsin is used to remove adherent cells from a culture surface |
| Tube | Sarstedt | 62,554,502 | Tube 15 mL, 120 mm x17 mm, PP |
| VBH 36 C2 Compact | Steril | ST-003009000 | Offers totally protection for the enviroment and worker |
| ZEISS Axio Vert.A1 – Inverted Microscope | Zeiss | 3849000962 | ZEISS Axio Vert.A1 provides a unique entry level price and can provide all contrasting techniques, including brightfield, phase contrast, PlasDIC, VAREL, improved Hoffman Modulation Contrast (iHMC), DIC and fluorescence. Incorporate LED illumination for gentle imaging for fluorescently-labeled cells. Axio Vert.A1 is ergonomically designed for routine work and compact enough to sit inside tissue culture hoods. |
References
- Robey, P. G., Kuznetsov, S. A., Riminucci, M., Bianco, P. Bone marrow stromal cell assays: in vitro and in vivo. Methods in Molecular Biology. 1130, 279-293 (2014).
- Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418, 1-49 (2002).
- Kern, S., Eichler, H., Stoeve, J., Kluter, H., Bieback, K. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue. Stem Cells. 24, 1294-1301 (2006).
- Zannettino, A. C. W., et al. Multi-potential Human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo. Journal of Cellular Physiology. 214, 413-421 (2008).
- Mattei, V., et al. Role of lipid rafts in neuronal differentiation of dental pulp-derived stem cells. Experimental Cell Research. 339, 231-240 (2015).
- Jansen, J., Hanks, S., Thompson, J. M., Dugan, M. J., Akard, L. P. Transplantation of hematopoietic stem cells from the peripheral blood. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 9 (1), 37-50 (2005).
- Young, F. I., et al. Clonal heterogeneity in the neuronal and glial differentiation of dental pulp stem/progenitor cells. Stem Cells International. 2016, 1290561 (2016).
- Pisciotta, A., et al. Human dental pulp stem cells (hDPSCs): isolation, enrichment and comparative differentiation of two sub-populations. BMC Developmental Biology. 15, 14 (2015).
- Atari, M., et al. Dental pulp of the third molar: a new source of pluripotent-like stem cells. Journal of Cell Science. 125, 3343-3356 (2012).
- Koyama, N., Okubo, Y., Nakao, K., Bessho, K. Evaluation of pluripotency in human dental pulp cells. Journal of oral and maxillofacial surgery: official journal of the American Association of Oral and Maxillofacial Surgeons. 67, 501-506 (2009).
- Gronthos, S., et al. Stem cell properties of human dental pulp stem cells. Journal of Dental Research. 81, 531-535 (2002).
- Arthur, A., Rychkov, G., Shi, S., Koblar, S. A., Gronthos, S. Adult human dental pulp stem cells differentiate toward functionally active neurons under appropriate environmental cues. Stem Cells. 7, 1787-1795 (2008).
- Lee, Y. J., Baskakov, I. V. The cellular form of the prion protein is involved in controlling cell cycle dynamics, self-renewal, and the fate of human embryonic stem cell differentiation. Journal of Neurochemistry. 124, 310-322 (2013).
- Steele, A. D., Emsley, J. G., Ozdinler, P. H., Lindquist, S., Macklis, J. D. Prion protein (PrPc) positively regulates neural precursor proliferation during developmental and adult mammalian neurogenesis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 3416-3421 (2006).
- Wulf, M. A., Senatore, A., Aguzzi, A. The biological function of the cellular prion protein: an update. BMC Biology. 15, 34 (2017).
- Mattei, V., et al. Recruitment of cellular prion protein to mitochondrial raft-like microdomains contributes to apoptosis execution. Molecular Biology of the Cell. 22, 4842-4853 (2011).
- Linden, R. The Biological Function of the Prion Protein: A Cell Surface Scaffold of Signaling Modules. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 77 (2017).
- Garofalo, T., et al. Role of mitochondrial raft-like microdomains in the regulation of cell apoptosis. Apoptosis. , 621-634 (2015).
- Watt, N. T., et al. Reactive oxygen species-mediated beta-cleavage of the prion protein in the cellular response to oxidative stress. The Journal of Biological Chemistry. 280, 35914-35921 (2005).
- Mattei, V., et al. Morphine Withdrawal Modifies Prion Protein Expression in Rat Hippocampus. PLoS One. 12, 0169571 (2017).
- Hu, W., et al. Prion proteins: physiological functions and role in neurological disorders. Journal of the Neurological Sciences. 264, 1-8 (2008).
- Sorice, M., et al. Trafficking of PrPC to mitochondrial raft-like microdomains during cell apoptosis. Prion. 6, 354-358 (2012).
- Martellucci, S., et al. Role of Prion protein-EGFR multimolecular complex during neuronal differentiation of human dental pulp-derived stem cells. Prion. 12 (2), 117-126 (2018).
- Lee, Y. J., Baskokov, I. V. The cellular form of the prion protein guides the differentiation of human embryonic stem cell into neuron-, oligodendrocyte- and astrocyte-committed lineages. Prion. 8, 266-275 (2014).
- Huang, G. T., Sonoyama, W., Chen, J., Park, S. H. In vitro characterization of human dental pulp cells: various isolation methods and culturing environments. Cell and Tissue Research. 324, 225-236 (2006).
- Suchanek, J., et al. Dental pulp stem cells and their characterization. Biomedical papers of the Medical Faculty of the University Palacký. 153, Olomouc, Czechoslovakia. 31-35 (2009).
- Bressan, E., et al. Donor age-related biological properties of human dental pulp stem cells change in nanostructured scaffolds. PLoS One. 7 (11), 49146 (2012).
