Post-differentiering Replating af humane pluripotente stamcelle-afledte neuroner for højt indhold screening af Neuritogenesis og synapse modning
Summary
Denne protokol beskriver en detaljeret procedure for tilbage suspendering og dyrkning af humane stamcelle afledte neuroner, der tidligere var differentieret fra neurale progenitorer in vitro i flere uger. Proceduren letter Imaging-baserede assays af neurites, synapser, og sent-udtrykker neuronal markører i et format, der er kompatibelt med lys mikroskopi og høj-indhold screening.
Abstract
Neuroner differentieret i to-dimensionelle kultur fra humane pluripotente stamcelle-afledte neurale stamceller (NPCs) repræsenterer en kraftfuld model system til at udforske sygdomsmekanismer og udføre høj indholds screening (HCS) at afhøre sammensatte biblioteker eller identificere genmutations fænotyper. Men, med humane celler overgangen fra NPC til funktionelle, modne neuron kræver flere uger. Synapser typisk begynder at danne efter 3 ugers differentiering i enkeltlags kultur, og flere neuron-specifikke proteiner, for eksempel den senere udtrykker pan-neuronal markør Neun, eller lag 5/6 cerebral kortikale neuron markør CTIP2, begynde at udtrykke omkring 4-5 uger efter differentiering. Denne lange differentierings periode kan være uforenelig med optimale dyrkningsbetingelser, der anvendes til små, multi-Well HCS-platforme. Blandt de mange udfordringer er behovet for godt overholdt, ensartet fordelte celler med minimal celle klyngedannelse, og kultur procedurer, der fremmer langsigtet levedygtighed og funktionel synapse modning. En tilgang er at differentiere neuroner i et stort volumen format, derefter replate dem på et senere tidspunkt i HCS-kompatible multi-brønde. Nogle af de vigtigste udfordringer ved anvendelse af denne plader-metode vedrører reproducerbarhed og cellelevedygtighed på grund af den stressende forstyrrelse af det dendritiske og axonale netværk. Her viser vi en detaljeret og pålidelig procedure for enzymatisk resuspension af menneskeskabte pluripotente stamceller (hipsc)-afledte neuroner efter deres differentiering for 4-8 uger i et stort volumen format, overføre dem til 384-brønd mikrotiterpladestrimler og dyrkning af dem i yderligere 1-3 uger med fremragende celle overlevelse. Denne plader af menneskelige neuroner giver ikke kun mulighed for studiet af synapse samling og modning inden for to uger fra plader, men også muliggør undersøgelser af neurite regenerering og vækst kegle egenskaber. Vi giver eksempler på skalerbare assays for neuritogenesis og synaptogenesis ved hjælp af en 384-Well platform.
Introduction
Humane pluripotente stamceller (hiPSC)-afledte neuroner er i stigende grad relevante inden for grundforskning, narkotika udvikling, og regenerativ medicin. Arbejdsprocesser og procedurer til at optimere deres kultur og vedligeholdelse, og forbedre effektiviteten af differentiering i specifikke neuronal undertyper, udvikler sig hurtigt1,2. For at forbedre nytten og omkostningseffektiviteten af menneskelige stamcelle-afledte neuroner som modelsystemer, der kan anvendes til højt indhold analyser i Drug Discovery og Target validering, er det nyttigt at mindske dyrknings tiden kræves for at generere modne, funktionelle neuroner, samtidig med at maksimal robusthed, reproducerbarhed og fænotype relevans bevares. Selv om 3-dimensionelle organoid kulturer kører gennembrud i Neuro udvikling forskning3, 2-dimensionelle enkeltlags kulturer er især kompatible med automatiserede Imaging-baserede applikationer på grund af deres minimal vævs tykkelse.
Men tilpasningen af billedbehandlings baserede screeningsmetoder til modeller af menneskelig neurologisk og neuroudviklingsmæssige sygdom står over for en stor udfordring. Den langvarige tidsramme, som det menneskelige nervesystem modnes in vivo nødvendiggør forlænget tid i kulturen til at rumme naturlige programmer for genekspression og opnå neuronal modning.
En praktisk konsekvens af den langvarige neuronal differentiering program er, at vedligeholdelsen af hipsc-afledte enkeltlags kulturer skal opretholdes i mange uger for at opnå tilstrækkelig synapse modenhed. I løbet af denne tid, neurale afkom, der forbliver udifferentieret fortsætte med at opdele. Disse kan hurtigt over vokse kulturen og tilrane sig det næringsstofindhold, der kræves for at opretholde levedygtige postmitotiske neuroner. Kraftigt dividere neurale progenitorceller (NPCs) kan også konkurrere med neuroner for vækst substrat. Dette kan gøre sådanne kulturer underlagt problemer med dårlig vedhæftning, en tilstand uegnet til billedbehandlings baserede assays. Desuden finder mange efterforskere, at jo mindre kultur volumen, jo større er vanskeligheden med at opretholde sunde populationer af differentierede neuroner længe nok til at observere de sene stadier af neuronal differentiering. Med andre ord, assays af synapse modning ved hjælp af højt indhold screening (HCS) tilgange kan være meget udfordrende for menneskelige-afledte neuroner.
For at omgå nogle af disse problemer er der blevet anvendt en procedure for tilbage suspension og plader af tidligere differentierede hipsc-afledte neuroner. For det første giver det mulighed for studiet af neurite udvækst (eller mere præcist neurite regenerering) i en population af fuldt engagerede neuroner. For det andet, at plader af tidligere differentierede neuroner fra et stort volumen format (som 10 cm plader eller større), ned til små volumen formater (som HCs-kompatible 96-eller 384-brønd mikrotiterplader) muliggør en signifikant reduktion i den samlede kultieringstid i den lille volumen tilstand. Dette letter studiet af synapse samling og modning over de efterfølgende uger in vitro.
Men, den plader af modne neuroner, der allerede har etableret lange neurites og en kompleks konnektivitet netværk præsenterer flere udfordringer, hvoraf den ene er den undertiden høj og variabel hastighed af celledød. Her beskriver vi en plader procedure, der resulterer i fremragende celle overlevelse og reproducerbarhed. Almindeligvis er neuroner eksponeret for Proteolytiske enzymer for korte inkubations perioder (typisk ~ 3-10 min) for at frigøre celler fra substratet før trituration. Denne korte proteolyse tid bruges sædvanligvis til at opsuspendere og passaging mange typer af skille celler, herunder ikke-neuronal celler og udifferentierede progenitorer4,5,6. Men for differentierede neuroner, der bærer lange, indbyrdes forbundne neuritter, er det vigtigt ikke blot at frigøre celler fra substratet, men også at forstyrre det dendritiske og axonal netværk for at isolere individuelle celler, samtidig med at skaden minimeres. Faktisk en tyk meshwork af neuroner normalt har tendens til at løsne sig fra substratet som et enkelt ark, snarere end som individuelle celler. Hvis der ikke udvises forsigtighed for at løsne det tykke netværk af neuritter, bliver neuroner ikke kun uopretteligt beskadiget under trituration, men mange af dem undlader at passere gennem filteret, der bruges til at fjerne klumper, hvilket resulterer i dårlig celle udbytte. Nedenfor beskriver vi en simpel modifikation til en bredt anvendt proteaseinkubations procedure for at imødegå disse vanskeligheder.
I den nedenfor beskrevne protokol inkuberet neuroner i 40-45 min med en mild protease, såsom det proteolytiske enzym (f. eks. Accutase). I løbet af de første 5-10 min efter tilsætning af enzymet, det neuronal netværk løfter fra substratet som et ark. Inkubation med proteasehæmmere provenuet for yderligere 30-40 min før du fortsætter med blid formalings og filtrering. Denne ekstra inkubationstid hjælper med at sikre, at fordøjelsen af materialet slapper af det intercellulære netværk, hvilket sikrer, at efterfølgende formalings giver en suspension af individuelle celler. Denne procedure maksimerer ensartetheden af celle fordelingen ved at plader, samtidig med at celledød minimeres. Vi har med succes anvendt denne plader metode til hipsc-afledte neuronal kulturer genereret af forskellige differentiering protokoller7,8 og fra forskellige linjer af hipscs. Proceduren er nominelt egnet til brug med de fleste eller alle linjer af stamcelle-afledte neuroner. Vi har observeret, at en forlænget proteaseinkubationstid ikke er absolut nødvendig for at udfylde kulturer fra små format plader (f. eks. 35 mm diameter); men som vi viser her, det giver en betydelig fordel, når plader fra store diameter plader (f. eks, 10 cm diameter eller større), sandsynligvis fordi neurites i sådanne plader kan forlænge meget lange processer og danne en tæt sammenkoblede array.
Her demonstrerer vi denne metode og illustrerer kort dens anvendelse i assays for tidlig neuritogenesis og for synapse modning, som involverer klyngedannelse af præ-og postsynaptiske proteiner langs dendritter og axoner, efterfulgt af deres senere samlokalisering på synaptisk sites. Eksemplerne fremhæver de fordele, som denne protokol giver for at bevare cellernes levedygtighed og reproducerbarhed. For det første, det tillader efterforskere at studere tidlige trin i human neuritogenesis. Den eksperimentelle indstilling svarer til de almindeligt anvendte primære kulturer af gnaver kortikale eller hippocampus neuroner, hvor cellerne udvindes fra sen føtal eller tidlig postnatale hjerne, dissocieret ved formalings efter blid proteasebehandling, og lov til at initiere neuritter eller regenerere neuritter, der blev afbrudt i proceduren9,10. På samme måde som sådanne gnaver primære neuroner begynder hiPSC-afledte neuroner at danne eller regenerere deres neuriter inden for timer efter replating, hvilket muliggør billeddannelse af vækst kegler og neurite morfologi i et miljø, der er optimalt til høj spatiotemporale billeddannelse med færre omgivende udifferentierede celler. Vi har observeret, at neurite udvækst er mere synkroniseret i forhold til de variable forsinkelser og forskellige udvækst satser set, når neuroner først begynder at skelne fra en stamcelle befolkning. Hertil kommer, at plader muliggør assays af neuroner udtrykker neuronal subtype markører, der typisk optræder senere i neurale udvikling, såsom den kortikale lag 5/6 transkriptionsfaktor CTIP2 (kylling ægalbumin upstream promotor transkription faktor-interagerende protein 2) eller den panneuronale markør NeuN11. En særlig nyttig funktion af den plader tilgang er, at synaptogenesis provenuet inden for en tidsramme kompatibel med HCs.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har demonstreret en straight-Forward procedure for opblanding og plader af menneskelige neuronal kulturer, der optimerer levedygtighed, differentiering succes, og subcellulære Imaging på en måde, der er kompatibel med højt indhold screening platforme, og andre analyser, som er relevante for lægemiddel opdagelsen. Figur 6 illustrerer den overordnede arbejdsgang og eksempler på sådanne applikationer.
Selv om vi her fokuserede på hiPSC-afledte neuroner, de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde er en del af de nationale kooperative omprogrammerede celle forskningsgrupper (NCRCRG) for at studere psykisk sygdom og blev støttet af NIH Grant U19MH1 2015-0644. Det oprindelige arbejde blev også støttet af NIH Grant NS070297. Vi takker DRs. Carol Marchetto og fred Gage, Salk Institute, for at levere WT 126 linje af neurale stamceller, og DRS. Eugene Yeo og Lawrence Goldstein, UC San Diego for at levere CVB WT24 linje af neurale stamceller. Vi takker Deborah pre i laboratoriet af Dr. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, for nyttige diskussioner.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
