Replacado posterior a la diferenciación de las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas para la detección de alto contenido de la neuritogénesis y la maduración de la sinapsis
Summary
Este protocolo describe un procedimiento detallado para recuperar y cultivar neuronas derivadas de células madre humanas que previamente se diferenciaron de los progenitores neuronales in vitro durante varias semanas. El procedimiento facilita ensayos basados en imágenes de neurótesis, sinapsis y marcadores neuronales de expresión tardía en un formato compatible con microscopía ligera y cribado de alto contenido.
Abstract
Las neuronas diferenciadas en el cultivo bidimensional de las células progenitoras neuronales derivadas de células madre humanas (NDC) representan un potente sistema modelo para explorar los mecanismos de la enfermedad y llevar a cabo pruebas de detección de alto contenido (HCS) para interrogar a un compuesto bibliotecas o identificar fenotipos de mutación genética. Sin embargo, con las células humanas la transición de NPC a funcional, neurona madura requiere varias semanas. Las sinapsis suelen comenzar a formarse después de 3 semanas de diferenciación en el cultivo monocapa, y varias proteínas específicas de la neurona, por ejemplo el marcador panneuronal nucina NucN, o el marcador de neurona cortical cerebral CTIP2 de capa 5/6, comienzan a expresar alrededor de 4-5 semanas después de la diferenciación. Este largo tiempo de diferenciación puede ser incompatible con las condiciones de cultivo óptimas utilizadas para plataformas HCS de pequeño volumen y varios pozos. Entre los muchos desafíos se encuentran la necesidad de células bien adheridas y distribuidas uniformemente con agrupamiento celular mínimo y procedimientos de cultivo que fomenten la viabilidad a largo plazo y la maduración funcional de la sinapsis. Un enfoque es diferenciar las neuronas en un formato de gran volumen, luego replacarlas en un momento posterior en multi-pozos compatibles con HCS. Algunos de los principales desafíos al utilizar este enfoque de replacado se refieren a la reproducibilidad y la viabilidad celular, debido a la interrupción estresante de la red dendrítica y axonal. Aquí demostramos un procedimiento detallado y confiable para resuspender enzimáticamente las neuronas derivadas de células madre pluripotentes inducidas por el ser humano (hiPSC) después de su diferenciación durante 4-8 semanas en un formato de gran volumen, transfiriéndolas a microtíterdes de 384 polos placas, y el cultivo de ellos para otros 1-3 semanas con excelente supervivencia celular. Este replato de neuronas humanas no sólo permite el estudio del ensamblaje y maduración de la sinapsis dentro de las dos semanas posteriores al replating, sino que también permite estudios de regeneración de neurita y características del cono de crecimiento. Proporcionamos ejemplos de ensayos escalables para neuritogénesis y sinaptogénesis utilizando una plataforma de 384 pozos.
Introduction
Las neuronas derivadas de células madre pluripotentes humanas (hiPSC) son cada vez más relevantes en las áreas de investigación básica, desarrollo de fármacos y medicina regenerativa. Los flujos de trabajo y procedimientos para optimizar su cultivo y mantenimiento, y mejorar la eficiencia de la diferenciación en subtipos neuronales específicos, están evolucionando rápidamente1,2. Para mejorar la utilidad y la rentabilidad de las neuronas derivadas de células madre humanas como sistemas modelo susceptibles de análisis de alto contenido en el descubrimiento de fármacos y la validación de objetivos, es útil disminuir el tiempo de cultivo necesario para generar neuronas, conservando al mismo tiempo la máxima robustez, reproducibilidad y relevancia fenotipo. Aunque los cultivos organoides tridimensionales están impulsando avances en la investigación de desarrollo neurológico3, los cultivos monocapa en 2 dimensiones son especialmente compatibles con aplicaciones automatizadas basadas en imágenes debido a su grosor mínimo de tejido.
Sin embargo, la adaptación de los métodos de detección basados en imágenes a modelos de enfermedades neurológicas y neurodesarrollo humanas se enfrenta a un desafío importante. El prolongado período de tiempo sobre el cual el sistema nervioso humano madura in vivo requiere un tiempo prolongado en el cultivo para acomodar programas naturales de expresión génica y lograr la maduración neuronal.
Una consecuencia práctica del programa de diferenciación neuronal prolongada es que el mantenimiento de cultivos monocapa derivados de hiPSC debe mantenerse durante muchas semanas para lograr una madurez adecuada de la sinapsis. Durante este tiempo, los progenitores neuronales que permanecen indiferenciados continúan dividiéndose. Estos pueden rápidamente sobrecrecer el cultivo y usurpar el contenido de nutrientes necesario para mantener neuronas postmitoticas viables. La división vigorosa de las células progenitoras neuronales (NNJ) también puede competir con las neuronas para el sustrato de crecimiento. Esto puede hacer que estos cultivos sean sujetos a problemas de mala adhesión, una condición inadecuada para ensayos basados en imágenes. Además, muchos investigadores encuentran que cuanto menor sea el volumen de cultivo, mayor será la dificultad para mantener poblaciones sanas de neuronas diferenciadas el tiempo suficiente para observar las últimas etapas de la diferenciación neuronal. En otras palabras, los ensayos de maduración de la sinapsis mediante enfoques de detección de alto contenido (HCS) pueden ser muy difíciles para las neuronas derivadas del ser humano.
Para eludir algunos de estos problemas, se ha utilizado un procedimiento de resupending y replating de neuronas derivadas de hiPSC previamente diferenciadas. En primer lugar, permite el estudio del crecimiento de neurita (o, más exactamente, regeneración de neurita) en una población de neuronas totalmente comprometidas. En segundo lugar, el replato de neuronas previamente diferenciadas de un formato de gran volumen (como placas de 10 cm o más), hasta formatos de volumen pequeño (como placas de microtíter compatibles con HCS de 96 o 384 pocillos) permite una reducción significativa en el tiempo total de cultivo en la condición de volumen pequeño. Esto facilita el estudio del montaje y maduración de la sinapsis durante las semanas posteriores in vitro.
Sin embargo, la replacación de neuronas maduras que ya han establecido neuritas largos y una compleja red de conectividad presenta varios desafíos, uno de los cuales es la tasa a veces alta y variable de muerte celular. Aquí, describimos un procedimiento de replating que resulta en una excelente supervivencia celular y reproducibilidad. Comúnmente, las neuronas están expuestas a enzimas proteolíticas durante períodos cortos de incubación (normalmente 3-10 min) con el fin de separar las células del sustrato antes de la trituración. Este breve tiempo de proteólisis se utiliza habitualmente para resuspender y pasar muchos tipos de células divisorias, incluyendo células no neuronales y progenitores indiferenciados4,5,6. Sin embargo, para las neuronas diferenciadas que soportan neuritas largos e interconectados, es esencial no sólo separar las células del sustrato, sino también para interrumpir la red dendrítica y axonal con el fin de aislar las células individuales mientras se minimiza el daño. De hecho, una malla gruesa de neuronas generalmente tiende a desprenderse del sustrato como una sola hoja, en lugar de como células individuales. Si no se tiene cuidado de aflojar la gruesa red de neurótesis, las neuronas no sólo se dañan irreversiblemente durante la trituración, sino que muchas de ellas no pasan a través del filtro utilizado para eliminar los grumos, lo que resulta en un rendimiento celular deficiente. A continuación describimos una simple modificación de un procedimiento de incubación de proteasa ampliamente utilizado para contrarrestar estas dificultades.
En el protocolo descrito a continuación, las neuronas se incuban durante 40-45 min con una proteasa leve, como la enzima proteolítica (por ejemplo, Accutase). Durante los primeros 5-10 minutos después de agregar la enzima, la red neuronal se levanta del sustrato como una hoja. La incubación con la proteasa procede durante 30-40 minutos adicionales antes de proceder con una suave trituración y filtrado. Este tiempo de incubación adicional ayuda a asegurar que la digestión del material relaja la red intercelular, asegurando así que la posterior trituración produzca una suspensión de células individuales. Este procedimiento maximiza la uniformidad de la distribución celular al replacar mientras minimiza la muerte celular. Hemos aplicado con éxito este método de replacado a cultivos neuronales derivados de hiPSC generados por varios protocolos de diferenciación7,8 y a partir de varias líneas de hiPSC. El procedimiento es nominalmente adecuado para su uso con la mayoría o todas las líneas de neuronas derivadas de células madre. Hemos observado que un tiempo de incubación de proteasa extendido no es absolutamente esencial para los cultivos de replacado a partir de placas de formato pequeño (por ejemplo, 35 mm de diámetro); sin embargo, como mostramos aquí, proporciona un beneficio significativo al replacar a partir de placas de gran diámetro (por ejemplo, 10 cm de diámetro o más), probablemente porque los neurófilos en tales placas pueden extender procesos muy largos y formar una matriz densamente interconectada.
Aquí demostramos este método e ilustramos brevemente su aplicación en ensayos para la neuritogénesis temprana y para la maduración de la sinapsis, que implica la agrupación de proteínas pre y postsinápticas a lo largo de las dendritas y axones, seguido de su posterior la colocación en sitios sinápticos. Los ejemplos destacan las ventajas que ofrece este protocolo para preservar la viabilidad y reproducibilidad celular. En primer lugar, permite a los investigadores estudiar los primeros pasos en la neuritogénesis humana. El entorno experimental es similar a los cultivos primarios comúnmente utilizados de neuronas corticales o hipocampales de roedores, donde las células se extraen del cerebro fetal tardío o postnatal temprano, se disocian por la trituración después de un tratamiento suave contra la proteasa, y se les permite iniciar neurites o regenerar neurites que fueron cortados en el procedimiento9,10. Al igual que estas neuronas primarias de roedores, las neuronas derivadas de hiPSC comienzan a formaro o regenerar sus neuritas en cuestión de horas después de la reposición, lo que permite tomar imágenes de conos de crecimiento y morfología de neurita en un entorno óptimo para imágenes de alta espaciotemporal con menos células indiferenciadas. Hemos observado que el crecimiento de neurita está más sincronizado en comparación con los retrasos variables y las diferentes tasas de crecimiento observadas cuando las neuronas comienzan a diferenciarse de una población progenitora. Además, el replating permite ensayos de neuronas que expresan marcadores neuronales de subtipo que normalmente aparecen más adelante en el desarrollo neuronal, como el factor de transcripción CTIP2 de capa cortical 5/6 (Transcripción del promotor de ovalbumina de pollo proteína interactúe n.o 2), o el marcador panneuronal NeuN11. Una característica especialmente útil del enfoque de replacado es que la sinaptogénesis continúa dentro de un marco de tiempo compatible con HCS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hemos demostrado un procedimiento directo para la resuspensión y reposición de cultivos neuronales humanos que optimiza la viabilidad, el éxito de la diferenciación y las imágenes subcelulares de una manera que es compatible con plataformas de cribado de alto contenido, y otros ensayos relevantes para el descubrimiento de fármacos. La Figura 6 ilustra el flujo de trabajo general y los ejemplos de dichas aplicaciones.
Aunque aquí nos centramos en las neurona…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es un componente de los Grupos Nacionales de Investigación Celular Reprogramada De Cooperativa (NCRCRG) para estudiar enfermedades mentales y fue apoyado por la subvención de NIH U19MH1 2015-0644. El trabajo inicial también fue apoyado por la concesión de NIH NS070297. Agradecemos a los Doctores Carol Marchetto y Fred Gage, The Salk Institute, por proporcionar la línea WT 126 de células progenitoras neuronales, y a los doctores Eugene Yeo y Lawrence Goldstein, UC San Diego, por proporcionar la línea CVB WT24 de células progenitoras neuronales. Agradecemos a Deborah Pre en el laboratorio de la Dra. Anne Bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, por discusiones útiles.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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