ニューウトジェネシスとシナプス成熟の高含有量スクリーニングに対するヒト多能性幹細胞由来ニューロンの分化後再形成
Summary
このプロトコルは、以前にインビトロで神経前駆体から数週間分化していたヒト幹細胞由来ニューロンを再中断および培養するための詳細な手順を説明する。この手順は、光顕微鏡検査および高含有量スクリーニングと互換性のある形式で、神経伝達物、シナプス、および後期発現ニューロンマーカーのイメージングベースのアッセイを容易にします。
Abstract
ヒト多能性幹細胞由来神経前駆細胞(NPC)と2次元培養で分化したニューロンは、疾患メカニズムを探索し、化合物を調知するための高含有スクリーニング(HCS)を行う強力なモデルシステムを表す。ライブラリまたは遺伝子変異現象を同定する。しかし、ヒト細胞ではNPCから機能への移行により、成熟したニューロンは数週間を要する。シナプスは通常、単層培養における3週間の分化後に形成を開始し、いくつかのニューロン特異的タンパク質、例えば後にパンニューロンマーカーNeuNを発現させる、または層5/6大脳皮質ニューロンマーカーCTIP2が発現し始める約4-5週間の分化後。この長い差別化時間は、少量のマルチウェルHCSプラットフォームに使用される最適な培養条件と互換性がありません。多くの課題の中には、細胞クラスタリングを最小限に抑えた均一に分布した細胞の必要性や、長期的な生存率と機能的シナプス成熟を促進する培養手順が必要です。1つのアプローチは、大容量フォーマットでニューロンを区別し、HCS互換マルチウェルで後の時点でそれらを再プレートすることです。このリプラットングアプローチを使用する際のいくつかの主な課題は、樹状および軸線ネットワークのストレスの多い中断のために、再現性と細胞の生存率に関する。ここでは、大容量フォーマットで4~8週間分化した後にヒト誘導多能性幹細胞(hiPSC)由来のニューロンを酵素的に再中断し、384ウェルマイクロチターに転送するための詳細で信頼性の高い手順を示します。プレート、および優れた細胞生存でさらに1〜3週間それらを培養する。このヒトニューロンの再起は、再めっきから2週間以内にシナプスアセンブリと成熟の研究を可能にするだけでなく、神経質再生と成長コーン特性の研究を可能にします。我々は、384ウェルプラットフォームを用いたニューリトジェネシスおよびシナプトジェネシスに対するスケーラブルなアッセイの例を提供する。
Introduction
ヒト多能性幹細胞(hiPSC)由来ニューロンは、基礎研究、創薬、再生医療の分野でますます重要になってきています。その培養とメンテナンスを最適化し、特定のニューロンサブタイプに対する分化の効率を向上させるワークフローと手順は、急速に進化している1,2.創薬や標的検証における高含有量の解析に対応するモデルシステムとしてのヒト幹細胞由来ニューロンの有用性と費用対効果を向上させるためには、成熟した機能を生成するために必要な培養時間を短縮することが有用である。最大の堅牢性、再現性、表現型の関連性を維持しながら、ニューロン。3次元オルガノイド培養は神経発達研究3のブレークスルーを推進していますが、2次元単層培養は組織厚が最小限に抑えられるため、自動イメージングベースのアプリケーションと特に互換性があります。
しかし、ヒト神経・神経発達疾患のモデルへの画像化によるスクリーニング方法の適応は大きな課題である。生体内で人間の神経系が成熟する長引く時間枠は、遺伝子発現の自然なプログラムに対応し、神経の成熟を達成するために培養の延長時間を必要とする。
長い神経分化プログラムの実用的な結果の1つは、hiPSC由来単層培養の維持が十分なシナプス成熟を達成するために何週間も持続されなければならないということです。この間、未分化のままの神経前駆子は分裂し続ける。これらはすぐに培養を過剰に成長させ、実行可能なポストマイト性ニューロンを維持するために必要な栄養素含有量を奪うことができます。神経前駆細胞(NPC)を活発に分割すると、増殖基板のニューロンと競合することもできる。これは、このような培養物を、画像ベースのアッセイに不適当な接着性の問題の対象にすることができる。さらに、多くの研究者は、培養量が小さいほど、分化ニューロンの健良な集団を維持する難易度が高く、神経分化の後期段階を観察するのに十分な長さであることがわかります。言い換えれば、高含有スクリーニング(HCS)アプローチを用いてシナプス成熟のアッセイは、ヒト由来ニューロンにとって非常に困難であり得る。
これらの問題のいくつかを回避するために、以前に分化されたhiPSC由来ニューロンを再中断および再め換えする手順が用いられた。第一に、それは完全にコミットされたニューロンの集団における神経伝達の成長(または、より正確には、神経伝達の再生)の研究を可能にする。第二に、以前に分化されたニューロンを大容量フォーマット(10cmプレート以上など)から小容量フォーマット(HCS互換96または384ウェルマイクロチタープレートなど)に再め合わせることで、総培養時間を大幅に短縮できます。小さなボリューム条件。これは、インビトロでのその後の数週間にわたってシナプスアセンブリと成熟の研究を容易にします。
しかし、すでに長いニューライトと複雑な接続ネットワークを確立している成熟したニューロンの再め換えは、いくつかの課題を提示し、そのうちの1つは、時には高く、可変的な細胞死率である。ここでは、優れた細胞生存率および再現性をもたらす再めっき手順について説明する。一般的に、ニューロンは、トリキュレーションの前に基板から細胞を切り離すために、短いインキュベーション期間(通常〜3〜10分)のプロテオ分解酵素に曝露されます。この短いプロテオシス時間は、非神経細胞および未分化前駆体4、5、6を含む多くのタイプの分裂細胞を再中断および通過するために慣例的に使用される。しかし、長く相互接続された神経突起を持つ分化ニューロンのためには、細胞を基板から切り離すだけでなく、損傷を最小限に抑えながら個々の細胞を分離するために樹状および軸網を破壊することが不可欠です。実際、ニューロンの厚いメッシュワークは、通常、個々の細胞としてではなく、単一のシートとして基板から切り離される傾向があります。神経突起の厚いネットワークを緩めるために注意を払わなければ、ニューロンはトリチュレーション中に不可逆的に損傷を受けるだけでなく、それらの多くは、塊を除去するために使用されるフィルタを通過できず、細胞収率が悪くなります。以下では、これらの困難に対抗するために広く使用されているプロテアーゼインキュベーション手順に対する簡単な改変について説明する。
以下に説明するプロトコルでは、ニューロンは、プロテオ溶解酵素(例えば、アキュターゼ)などの軽度のプロテアーゼを用いて40〜45分間インキュベートされる。酵素を添加した後の最初の5〜10分の間に、ニューロンネットワークはシートとして基板から離陸する。プロテアーゼを用いたインキュベーションは、穏やかなトリタースとフィルタリングを進める前に、さらに30〜40分間進行します。この余分なインキュベーション時間は、材料の消化が細胞間ネットワークを緩和し、それによって後続のトリチュレーションが個々の細胞の懸濁液を生成することを保証するのに役立ちます。この手順は、細胞死を最小限に抑えながら再めっき時の細胞分布の均一性を最大化する。このリプラット法は、様々な分化プロトコル7、8、および様々なヒトCCから生成されたhiPSC由来のニューロン培養に応用することに成功しました。この手順は、名目上、幹細胞由来ニューロンのほとんどまたはすべての行での使用に適しています。我々は、拡張プロテアーゼインキュベーション時間が小さなフォーマットプレート(例えば、直径35ミリメートル)から培養物を再め換えに絶対に不可欠ではないことを観察しました。しかし、ここで示すように、大口径プレート(直径10cm以上)から再メッキする場合、おそらくそのようなプレート内のニューライトは非常に長いプロセスを拡張し、密に相互接続されたアレイを形成することができるため、大きな利点を提供します。
ここでは、この方法をデモンストレーションし、早期のニュー泌形成およびシナプス成熟のためのアッセイにおけるその応用を簡単に説明します。シナプスサイトでのコローカリゼーション。例では、このプロトコルが細胞の生存率と再現性を維持する上で提供する利点を強調しています。まず、研究者がヒトの新生の初期のステップを研究することを可能にする。実験設定は、げっ歯類皮質または海馬ニューロンの一次培養物に似ており、細胞は後期胎児または出生後の脳から抽出され、穏やかなプロテアーゼ治療後のトリチュレーションによって解離され、ニューライトを開始するか、手順9、10で切断されたニューライトを再生する。このようなげっ歯類の一次ニューロンと同様に、hiPSC由来のニューロンは、再形成後数時間以内にニューライトを形成または再生し始め、より少ない高い時空間イメージングに最適な環境で成長コーンおよびニューライト形態のイメージングを可能にする。周囲の未分化細胞。ニューロンが最初に前駆体集団から分化し始めたときに見られる可変遅延と異なる成長速度と比較して、神経突起の成長がより同期していることを観察しました。さらに、再めっきは、皮質層5/6転写因子CTIP2(チキンオブアルブミン上流プロモーター転写)などの神経発達の後半に現れるニューロンサブタイプマーカーを発現するニューロンのアッセイを可能にする。因子相互作用タンパク質2)、またはパンニューロンマーカーNeuN11.リメッキアプローチの特に有用な特徴は、HCSと互換性のある時間枠内でシナプトジェネシスが進行することです。
Protocol
Representative Results
Discussion
我々は、高含有量スクリーニングプラットフォームと互換性のある方法で、生存率、分化の成功、および細胞内イメージングを最適化するヒトニューロン培養の再停止と再平行化のための簡単な手順を実証しました。創薬に関連する他のアッセイ。図 6は、このようなアプリケーションの全体的なワークフローと例を示しています。
ここでは、皮質…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、精神疾患を研究する全国協同再プログラム細胞研究グループ(NCRCRG)の構成要素であり、NIH助成金U19MH1 2015-0644の支援を受けています。初期の作業は、NIH認可NS070297によってもサポートされました。私たちは、神経前駆細胞のWT 126ラインを提供してくれたキャロル・マルケット博士とフレッド・ゲージ博士、および神経前駆細胞のCVB WT24ラインを提供してくれたユージーン・ヨー博士とローレンス・ゴールドスタイン博士に感謝します。サンフォード・バーナム・プレビーズ医学発見研究所のアン・バン博士の研究室で、有益な議論をしてくださったデボラ・プレに感謝します。
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
