신형성 및 시냅스 성숙의 고함량 스크리닝을 위한 인간 다능성 줄기 세포 유래 뉴런의 분화 후 리포팅
Summary
이 프로토콜은 이전에 여러 주 동안 시험관 내 신경 전구체로부터 분화 된 인간 줄기 세포 유래 뉴런을 재중단하고 배양하기위한 상세한 절차를 설명합니다. 이 절차는 경질 현미경 검사법 및 고함량 스크리닝과 호환되는 형식으로 neurites, 시냅스 및 늦게 발현되는 뉴런 마커의 이미징 기반 검술을 용이하게 합니다.
Abstract
인간 다능성 줄기 세포 유래 신경 전구 세포 (NPC)에서 2 차원 배양으로 분화 된 뉴런은 질병 메커니즘을 탐구하고 화합물을 심문하는 고함량 스크리닝 (HCS)을 수행하는 강력한 모델 시스템을 나타냅니다. 라이브러리 또는 유전자 돌연변이 표현형을 식별합니다. 그러나, 인간 세포와 함께 NPC에서 기능으로의 전환, 성숙한 뉴런은 몇 주가 필요합니다. 시냅스는 전형적으로 단층 배양에서 분화의 3 주 후에 형성하기 시작하고, 몇몇 신경 특이적 단백질, 예를 들면 나중에 pan-neuronal 마커 NeuN, 또는 층 5/6 대뇌 피질 신경 마커 CTIP2를 발현하는, 발현하기 시작합니다 약 4-5 주 후 차별화. 이 긴 분화 시간은 소량의 다중 웰 HCS 플랫폼에 사용되는 최적의 배양 조건과 호환되지 않을 수 있습니다. 많은 과제 중 에는 최소한의 세포 군집으로 잘 부착되고 균일하게 분포된 세포와 장기적인 생존력과 기능성 시냅스 성숙을 촉진하는 배양 절차가 필요합니다. 한 가지 접근법은 큰 볼륨 형식으로 뉴런을 분화한 다음 HCS 호환 멀티 웰의 나중 시점에서 뉴런을 재플레이트하는 것입니다. 이 보충 접근법을 사용할 때 몇몇 주요 도전은 수지상 및 축색 네트워크의 스트레스 중단 때문에 재현성 및 세포 생존을 염려합니다. 여기에서 우리는 4-8 주 동안 대용량 형식으로 분화 한 후 인간 유도 만능 줄기 세포 (hiPSC) 파생 뉴런을 효소적으로 재중단시키는 상세하고 신뢰할 수있는 절차를 입증하여 384 웰 마이크로 티터로 옮김합니다. 플레이트, 우수한 세포 생존과 함께 추가로 1-3 주 동안 그들을 배양. 인간 뉴런의 이 보충은 시냅스 어셈블리의 연구와 보충에서 2 주 안에 성숙의 연구를 허용할 뿐만 아니라, 또한 신경질성 재생 및 성장 콘 특성의 연구를 가능하게 합니다. 우리는 384 웰 플랫폼을 사용하여 신생 및 시냅토 발생에 대한 확장 가능한 분석의 예를 제공합니다.
Introduction
인간 만능 줄기 세포 (hiPSC) 유래 뉴런은 기초 연구, 약물 개발 및 재생 의학 분야에서 점점 더 관련이 있습니다. 워크플로우 및 프로시저들은 그들의 배양 및 유지관리를 최적화하고, 특정 뉴런 아류형으로의 분화효율을 향상시키고, 급속히 진화하고 있다1,2. 모델 시스템으로서 인간 줄기 세포 유래 뉴런의 유용성과 비용 효율성을 향상시키기 위해 약물 발견 및 표적 검증에서 고함량 분석을 수행할 수 있으며, 성숙하고 기능적인 뉴런을 생성하는 데 필요한 배양 시간을 줄이는 것이 유용하다. 최대 견고성, 재현성 및 표현형 관련성을 유지하면서 뉴런을 유지합니다. 3차원 오르가노이드 배양이 신경 발달 연구3에서돌파구를 주도하고 있지만, 2차원 단층 문화는 최소한의 조직 두께로 인해 자동화된 이미징 기반 응용 분야와 특히 호환됩니다.
그러나, 인간 신경및 신경 발달 질병의 모형에 화상 진찰 기지를 둔 검열 방법의 적응은 중요한 도전에 직면합니다. 인간 신경계가 생체 내에서 성숙하는 연장된 기간은 유전자 발현의 자연적인 프로그램을 수용하고 신경 성숙을 달성하기 위해 문화에서 연장 된 시간을 필요로합니다.
긴 신경 분화 프로그램의 한 가지 실질적인 결과는 hiPSC 유래 단층 배양의 유지가 적절한 시냅스 성숙을 달성하기 위해 몇 주 동안 지속되어야한다는 것입니다. 이 시간 동안, 미분화 남아 있는 신경 선조는 분열을 계속합니다. 이들은 신속 하 게 문화를 성장 하 고 실행 가능한 postmitotic 신경 세포를 유지 하는 데 필요한 영양소 콘텐츠를 usurp 수 있습니다. 신경 전구 세포 (NPC)를 적극적으로 분할하는 것은 또한 성장 기판에 대한 뉴런과 경쟁 할 수 있습니다. 이것은 나쁜 접착의 문제, 화상 진찰 기지를 둔 비검사에 적합하지 않은 조건에 그 같은 문화를 렌더링할 수 있습니다. 더욱이, 많은 연구자들은 배양량이 작을수록, 신경분화의 후기 단계를 관찰할 수 있을 만큼 충분히 긴 분화 뉴런의 건강한 집단을 유지하는 데 더 큰 어려움이 있다는 것을 발견한다. 즉, 고함량 스크리닝(HCS) 접근법을 이용한 시냅스 성숙의 어설션은 인간 유래 뉴런에 대해 매우 어려울 수 있다.
이러한 문제 중 일부를 우회하기 위해 이전에 차별화된 hiPSC 유래 뉴런을 다시 일시 중단하고 보충하는 절차가 사용되었습니다. 첫째, 그것은 완전히 헌신 된 뉴런의 인구에서 neurite 파생 (또는 더 정확하게는 neurite 재생)에 대한 연구를 허용합니다. 둘째, 이전에 분화된 뉴런을 대용량(예: 10cm 플레이트 이상)에서 작은 볼륨 형식(예: HCS 호환 96- 또는 384웰 마이크로티터 플레이트)까지 재구성하면 총 배양 시간을 크게 줄일 수 있습니다. 볼륨 조건이 작습니다. 이것은 시험관내에서 후속 주에 걸쳐 시냅스 조립 및 성숙의 연구를 용이하게한다.
그러나, 이미 긴 neurites및 복잡한 연결 네트워크를 설치한 성숙한 뉴런의 replating는 몇몇 도전을 제출합니다, 그 중 하나는 때때로 높고 가변적인 세포 사멸의 비율입니다. 여기에서, 우리는 우수한 세포 생존 및 재현성 귀착되는 보충 절차를 기술합니다. 일반적으로, 뉴런은 짧은 잠복기 (전형적으로 ~ 3-10 분) 삼조 전에 기질에서 세포를 분리하기 위해 proteolytic 효소에 노출됩니다. 이 짧은 proteolysis 시간은 관례적으로 비 신경 세포 및 미분화 선조4,5,6을포함하여 분할 세포의 많은 모형을 중단하고 통과시키기 위해 이용됩니다. 그러나, 길고 상호 연결된 신경염을 가진 분화한 뉴런의 경우, 기판에서 세포를 분리하는 것뿐만 아니라 손상을 최소화하면서 개별 세포를 격리하기 위해 수지상 및 축색 네트워크를 방해하는 것이 필수적입니다. 실제로, 뉴런의 두꺼운 메쉬 워크는 일반적으로 개별 세포보다는 단일 시트로 기판에서 분리하는 경향이있다. 신경질의 두꺼운 네트워크를 느슨하게하기 위해 주의를 기울이지 않으면 뉴런은 삼중 화 중에 돌이킬 수 없을 정도로 손상될뿐만 아니라 많은 사람들이 덩어리를 제거하는 데 사용되는 필터를 통과하지 못하여 세포 수율이 떨어집니다. 아래에서 우리는 이러한 어려움에 대처하기 위해 널리 사용되는 프로테아제 배양 절차에 대한 간단한 수정을 설명합니다.
아래에 기술된 프로토콜에서, 뉴런은 프로테오용 효소(예를 들어, Accutase)와 같은 가벼운 프로테아제와 함께 40-45분 동안 배양된다. 효소를 첨가한 후 처음 5-10분 동안, 뉴런 네트워크는 시트로서 기판으로부터 들어올린다. 프로테아제와의 인큐베이션은 부드러운 삼각 및 여과로 진행하기 전에 추가로 30-40 분 동안 진행됩니다. 이 추가 배양 시간은 물질의 소화가 세포 간 네트워크를 이완시키는 것을 보장하는 데 도움이, 따라서 후속 삼조는 개별 세포의 현탁액을 생성하는 것을 보장. 이 절차는 세포 사멸을 최소화하면서 보충시 세포 분포의 균일성을 극대화합니다. 우리는 성공적으로 hiPSC 파생된 신경 배양에 이 replating 방법을 다양한 분화 프로토콜7,8 및 hiPSCs의 각종 선에서 생성된 적용했습니다. 절차는 줄기 세포 파생된 신경세포의 대부분 또는 전부와 함께 사용하기에 명목상 에 적당합니다. 우리는 확장 된 프로테아제 배양 시간이 작은 형식 의 플레이트 (예를 들어, 35mm 직경)에서 배양을 보충하는 데 절대적으로 필수적이지 않다는 것을 관찰했습니다. 그러나 여기에서 볼 수 있듯이, 이러한 플레이트의 neurites가 매우 긴 공정을 확장하고 조밀하게 상호 연결된 배열을 형성 할 수 있기 때문에 큰 직경의 플레이트 (예 : 직경 10cm 이상)에서 보충 할 때 상당한 이점을 제공합니다.
여기에서 우리는 이 방법을 설명하고 초기 신생에 대한 분석과 시냅스 성숙에 대한 분석에서 그 적용을 간략하게 설명하며, 이는 수상돌기와 축삭을 따라 전과 후의 후배 단백질을 군집화하는 것을 포함하고, 그 다음에 그들의 후에 시냅스 사이트에서 의 국소화. 이 예제에서는 이 프로토콜이 세포 생존가능성과 재현성을 보존하는 데 제공하는 이점을 강조합니다. 첫째, 그것은 인간 적인 신생에 있는 초기 단계를 공부하는 조사자가 허용합니다. 실험 설정은 설치류 피질 또는 해마 뉴런의 일반적으로 사용되는 기본 문화와 유사하며, 여기서 세포는 늦은 태아 또는 초기 산후 뇌에서 추출되고, 부드러운 프로테아제 치료 후 삼각에 의해 해리되고, 허용 신경을 시작하거나 절차9,10에서절단 된 신경 을 재생합니다. 이러한 설치류 기본 뉴런과 유사하게, hiPSC 유래 뉴런은 보충 후 몇 시간 내에 신경 세포를 형성하거나 재생하기 시작하여 적은 수의 높은 시공간 이미징에 최적 환경에서 성장 원추형 및 신경 세포형성의 이미징을 허용합니다. 미분화 세포를 둘러싸고 있습니다. 우리는 뉴런이 처음 선조 집단과 구별하기 시작할 때 볼 수있는 가변 지연 및 다른 파생 속도에 비해 neurite 의 성장은 더 동기화되는 것을 관찰했습니다. 또한, replating은 피질 층 5/6 전사 인자 CTIP2 (치킨 ovalbumin 업스트림 프로모터 전사와 같은 신경 발달에서 일반적으로 나중에 나타나는 신경 아류형 마커를 발현하는 뉴런의 분석분석서를 가능하게 합니다) 인자 상호 작용 단백질 2), 또는 범 뉴런 마커 NeuN11. 리피팅 접근법의 특히 유용한 특징은 시냅토발생이 HCS와 호환되는 시간 프레임 내에서 진행된다는 것입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 높은 콘텐츠 스크리닝 플랫폼과 호환되는 방식으로 생존, 분화 성공 및 세포 외 이미징을 최적화하는 인간 신경 배양물의 재중단 및 보충을 위한 정직한 절차를 입증했습니다. 및 약물 발견과 관련된 기타 검사. 그림 6은 이러한 응용 프로그램의 전반적인 워크플로우 및 예제를 보여 줍니다.
여기서 우리는 피질 뉴런 운명을 향한 hiPSC 파생 뉴런에…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 정신 질환을 연구하기 위해 국립 협동 세포 연구 그룹 (NCRCRG)의 구성 요소이며 NIH 보조금 U19MH1 2015-0644에 의해 지원되었다. 초기 작업은 또한 NIH 교부금 NS070297에 의해 지원되었다. 우리는 박사 캐롤 마르케토와 프레드 게이지, 신경 전구 세포의 WT 126 라인을 제공, 박사 유진 여와 로렌스 골드스타인, UC 샌디에고 신경 전구 세포의 CVB WT24 라인을 제공에 대한 감사드립니다. 우리는 박사 앤 방의 실험실에서 데보라 프리 감사합니다, 샌포드 번햄 프리디스 의료 발견 연구소, 유용한 토론.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
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