Post-differensiering Replating av Human pluripotent Stem Cell-avledet neurons for High-Content screening av Neuritogenesis og synapse modning
Summary
Denne protokollen beskriver en detaljert prosedyre for blanding og dyrking menneskelige stilk cellen avledet neurons som tidligere var differensiert fra neural forfedre in vitro for flere uker. Prosedyren forenkler Imaging-baserte analyser av neurites, synapser, og sen-uttrykker neuronal markører i et format som er kompatibelt med lys mikroskopi og høyt innhold screening.
Abstract
Neurons differensiert i to-dimensjonal kultur fra menneskelige pluripotent stilk-cellen-avledet nevrale stamceller (NPCer) representerer en kraftig modell system for å utforske sykdoms mekanismer og utføre høyt innhold screening (HCS) å forhøre sammensatte biblioteker eller identifisere genmutasjon fenotyper. Men med menneskelige celler overgangen fra NPC til funksjonell, krever eldre Nevron flere uker. Synapser vanligvis begynner å danne etter 3 uker med differensiering i monolag kultur, og flere Nevron-spesifikke proteiner, for eksempel senere uttrykker Pan-neuronal markør NeuN, eller laget 5/6 cerebral kortikale Nevron markør CTIP2, begynner å uttrykke rundt 4-5 uker etter differensiering. Denne lange differensiering tid kan være uforenlig med optimal kultur forhold som brukes for små volum, multi-brønn HCS plattformer. Blant de mange utfordringene er behovet for godt overholdt, jevnt fordelt celler med minimal celle Clustering, og kultur prosedyrer som fremmer langsiktig levedyktighet og funksjonell synapse modning. En tilnærming er å skille neurons i et stort volum format, så replate dem på et senere tidspunkt i HCS-kompatible multi-brønner. Noen viktige utfordringer når du bruker denne replating tilnærmingen bekymring reproduserbarhet og celle levedyktighet, på grunn av stressende avbrudd i dendrittiske og axonal nettverk. Her viser vi en detaljert og pålitelig prosedyre for enzymatisk blanding humant indusert pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons etter deres differensiering for 4-8 uker i et stort volum format, overføre dem til 384-vel mikrotiterbrønnene plater, og dyrking dem for ytterligere 1-3 uker med utmerket celle overlevelse. Denne replating av menneskelige neurons ikke bare tillater studiet av synapse montering og modning innen to uker fra replating, men også muliggjør studier av neurite regenerering og vekst membran egenskaper. Vi gir eksempler på skalerbare analyser for neuritogenesis og synaptogenesis ved bruk av en 384-brønn plattform.
Introduction
Human pluripotent stilk cellen (hiPSC)-avledet neurons blir stadig mer relevant i de områdene av grunnleggende forskning, narkotika utvikling, og regenererende medisin. Arbeidsflyter og prosedyrer for å optimalisere deres kultur og vedlikehold, og forbedre effektiviteten av differensiering i bestemte neuronal under typer, utvikler seg raskt1,2. For å forbedre nytte og kostnadseffektivitet av menneskelig stilk cellen-avledet neurons som modellsystemer mottagelig for høyt innhold analyser i legemiddel funnet og mål validering, er det nyttig å redusere dyrking tiden som kreves for å generere modne, funksjonelle og samtidig beholde maksimal robusthet, reproduserbarhet og fenotype relevans. Selv om 3-dimensjonale organoid kulturer kjører gjennombrudd i neurodevelopment forskning3, 2-dimensjonale monolag kulturer er spesielt kompatible med automatiserte Imaging-baserte applikasjoner på grunn av deres minimale vev tykkelse.
Men tilpasningen av Imaging-baserte screening metoder til modeller av menneskelig nevrologisk og neurodevelopmental sykdom står overfor en stor utfordring. Den langvarige tidsrammen over hvor det menneskelige nervesystemet modnes i vivo nødvendiggjør utvidet tid i kulturen for å imøtekomme naturlige programmer av genuttrykk og oppnå neuronal modning.
En praktisk konsekvens av den langvarige neuronal differensiering programmet er at vedlikehold av hiPSC-avledet monolag kulturer må opprettholdes i mange uker for å oppnå tilstrekkelig synapse modenhet. I løpet av denne tiden, nevrale forfedre som forblir udifferensierte fortsette å dele. Disse kan raskt overgrow kulturen og tilrive næringsinnholdet som kreves for å opprettholde levedyktige postmitotic neurons. Kraftig dele nevrale stamceller (NPCer) kan også konkurrere med neurons for vekst underlaget. Dette kan gjøre slike kulturer utsatt for problemer med dårlig vedheft, en tilstand uegnet for Imaging-baserte analyser. Videre mange etterforskere finner at jo mindre kulturen volum, jo større vanskeligheter med å opprettholde sunne populasjoner av differensiert neurons lenge nok til å observere den sene stadier av neuronal differensiering. Med andre ord kan analyser av synapse modning ved hjelp av høyt innhold screening (HCS) tilnærminger være svært utfordrende for menneskeskapte neurons.
For å omgå noen av disse problemene, en prosedyre for blanding og replating tidligere differensiert hiPSC-avledet neurons har blitt brukt. For det første tillater det studiet av neurite utvekst (eller, mer presist, neurite regenerering) i en populasjon av fullt engasjerte neurons. For det andre, replating av tidligere differensiert neurons fra et stort volum format (som 10 cm plater eller større), ned til små volum formater (som HCS-kompatible 96-eller 384-vel mikrotiterbrønnene plater) gir en betydelig reduksjon i total dyrking tid i den lille volum tilstanden. Dette forenkler studiet av synapse forsamling og modning over påfølgende uker in vitro.
Men replating av modne neurons som allerede har etablert lange neurites og en kompleks tilkobling nettverk presenterer flere utfordringer, hvorav den ene er noen ganger høy og variabel hastighet på celle død. Her beskriver vi en replating prosedyre som resulterer i utmerket celle overlevelse og reproduserbarhet. Vanligvis er neurons eksponert for proteolytiske enzymer for korte inkubasjons perioder (vanligvis ~ 3-10 min) for å løsne celler fra underlaget før trituration. Denne korte proteinolyse tiden brukes vanligvis for blanding og passaging mange typer dele celler, inkludert ikke-neuronal celler og udifferensierte forfedre4,5,6. Men for differensiert neurons bærende lange, sammenkoblede neurites, er det viktig ikke bare å løsne celler fra underlaget, men også for å forstyrre dendrittiske og axonal nettverk for å isolere enkelte celler samtidig minimere skade. Faktisk, en tykk meshwork av neurons vanligvis en tendens til å løsne fra underlaget som et enkelt ark, snarere enn som individuelle celler. Hvis omsorg ikke er tatt for å løsne den tykke nettverk av neurites, neurons ikke bare bli irreversibelt skadet under trituration, men mange av dem ikke klarer å passere gjennom filteret som brukes til å fjerne klumper, noe som resulterer i dårlig celle yield. Nedenfor beskriver vi en enkel modifikasjon til en mye brukt protease inkubasjons prosedyre for å motvirke disse vanskelighetene.
I protokollen beskrevet nedenfor, neurons er inkubert for 40-45 min med en mild protease, slik som proteolytiske enzym (f. eks, Accutase). I løpet av de første 5-10 min etter å ha lagt enzymet, neuronal nettverket heiser ut fra underlaget som et ark. Inkubasjons med protease provenyet for ytterligere 30-40 min før du fortsetter med skånsom trituration og filtrering. Denne ekstra inkubasjonstiden bidrar til å sikre at fordøyelsen av materialet slapper av intercellulære nettverket, og dermed sikre at påfølgende trituration produserer en suspensjon av individuelle celler. Denne prosedyren maksimerer ensartethet av celle distribusjon ved replating mens minimere celle død. Vi har med hell brukt denne replating metoden til hiPSC-avledet neuronal kulturer generert av ulike differensiering protokoller7,8 og fra ulike linjer av hiPSCs. Prosedyren er nominelt egnet for bruk med de fleste eller alle linjer med stilk cellen-avledet neurons. Vi har observert at en utvidet protease inkubasjonstid ikke er helt nødvendig for replating kulturer fra små format plater (f. eks, 35 mm diameter); men som vi viser her, gir det en betydelig fordel når replating fra stor diameter plater (f. eks, 10 cm diameter eller større), sannsynligvis fordi neurites i slike plater kan forlenge svært lange prosesser og danner et tett sammenvevd array.
Her demonstrerer vi denne metoden og illustrerer kort dens anvendelse i analyser for tidlig neuritogenesis og for synapse modning, som innebærer gruppering av pre-og postsynaptic proteiner langs dendrites og axons, etterfulgt av deres senere colocalization på Synaptic nettsteder. Eksemplene fremhever fordelene denne protokollen tilbyr for å bevare celle levedyktighet og reproduserbarhet. For det første tillater etterforskerne å studere tidlige skritt i menneskets neuritogenesis. Det eksperimentelle innfatning er analog med det vanligvis anvendt primære kulturen av gnager kortikale eller hippocampus neurons, der hvor celler er utdraget fra sen Foster eller tidlig postnatal hjerne, dissosiert av trituration etter mild protease handling, og innrømmet å initiere neurites eller regenerere neurites som var kuttet i prosedyren9,10. I likhet med slike gnager primære neurons, hiPSC-avledet neurons begynner å danne eller regenerere sine neurites innen timer etter replating, slik at bildebehandling av vekst kjegler og neurite morfologi i et miljø optimal for høy spatiotemporal Imaging med færre omkringliggende udifferensierte celler. Vi har observert at neurite utvekst er mer synkronisert i forhold til variable forsinkelser og ulike utvekst rater sett når neurons første begynner å skille fra en stamfar befolkning. I tillegg replating muliggjør analyser av neurons uttrykke neuronal under type markører som vanligvis vises senere i neural utvikling, for eksempel kortikale lag 5/6 transkripsjon faktor CTIP2 (Chicken ovalbumin oppstrøms promoter transkripsjon faktor-samspill protein 2), eller Pan-neuronal markør NeuN11. En særlig nyttig ansiktstrekk av det replating adgang er det alt synaptogenesis utbytte innen en tid rammen forenlig med HCS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi har vist en rett frem prosedyre for blanding og replating av menneskelig neuronal kulturer som optimaliserer levedyktighet, differensiering suksess, og subcellulære Imaging på en måte som er kompatibel med høyt innhold screening plattformer, og andre analyser som er relevante for legemiddel funn. Figur 6 illustrerer den generelle arbeidsflyten og eksempler på slike programmer.
Selv om her har vi fokusert på hiPSC-avledet neurons som er rettet mot en korti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet er en del av National Cooperative omprogrammeres Cell Research groups (NCRCRG) for å studere psykiske lidelser og ble støttet av NIH stipend U19MH1 2015-0644. Innledende arbeid ble også støttet av NIH Grant NS070297. Vi takker DRS. Carol Marchetto og fred Gage, The Salk Institute, for å gi den WT 126 linje av nevrale stamceller, og DRS. Eugene Yeo og Lawrence Goldstein, UC San Diego for å gi CVB WT24 linje med nevrale stamceller. Vi takker Deborah pre i laboratoriet av Dr. Anne bang, Sanford Burnham Prebys Medical Discovery Institute, for nyttige diskusjoner.
Materials
| Post Replating Media | |||
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A4403 | Add 1ml of 200mM stock to 1L of N2B27 media |
| dibutyryl-cAMP | Sigma | D0627 | Add 1 µM |
| Human BDNF | Peprotech | 450-02 | 10 ng/ml final concentration |
| B27 (50X) | Thermofisher Scientific | 17504044 | Add 20 ml to 1L N2B27 media |
| DMEM/F12 with Glutamax | Thermofisher Scientific | 31331093 | Add N2 and distribute in 50 mL conicals; parafilm wrap lids |
| Human GDNF | Peprotech | 450-10 | 10 ng/ml final concentration |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050038 | Add 10 ml to 1L N2B27 media; glutamine supplement |
| Mouse Laminin | Sigma | P3655-10mg | Add 100 µl to 50 mL N2B27 |
| MEM Nonessential Amino Acids | Thermofisher Scientific | 11140035 | Add 5ml to 1L N2B27 media |
| N2 (100X) Supplement | Life Technologies | 17502048 | Add 5ml to 500mL media |
| Neurobasal A Media | Thermofisher Scientific | 10888022 | Combine with DMEM/F12 to generate N2B27 media for CVB wt cells; neural basal A media |
| Neurobasal Media | Thermofisher Scientific | 21103049 | for WT126 cells; neural basal media |
| SM1 Supplement | StemCell Technologies | 5711 | Add 1:50 to media |
| sodium bicarbonate | Thermofisher Scientific | 25080-094 | Add 10ml to 1L N2B27 media |
| Plate Preparation | |||
| 10cm Tissue Culture Dishes | Fisher Scientific | 08772-E | Plastic TC-treated dishes |
| 6-well Tissue Culture Dishes | Thomas Scientific | 1194Y80 | NEST plates |
| Mouse Laminin | Life Technologies | 23017-015 | Add 1:400 on plastic |
| Poly-Ornithine | Sigma | P3655-10mg | Add 1:1000 on plastic |
| UltraPure Distilled Water | Life Technologies | 10977-015 | To dilute Poly-L-Ornithine |
| Replating Reagents | |||
| 100mM Cell Strainer | Corning | 431752 | Sterile, individually wrapped |
| 384-well plate, uncoated | PerkinElmer | 6007550 | Coat with PLO and Laminin |
| DPBS | Life Technologies | 14190144 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
| Poly-D-Lysine-Precoated 384-well Plates | PerkinElmer | 6057500 | Rinse before coating with laminin |
| StemPro Accutase | Life Technologies | A1110501 | Apply 1mL/10cm plate for 30-45 minutes; proteolytic enzyme |
| Fixation Materials | |||
| 37% Formaldehyde | Fisher Scientific | F79-1 | Dissolved in PBS |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-12 | 0.8 g per 10 ml of fixative |
| Immunostaining Materials | |||
| Alexa Fluor 488 Goat anti-mouse | Invitrogen | A-11001 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 568 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-11041 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 647 Goat anti-chicken | Invitrogen | A-21449 | secondary antibody |
| Alexa Fluor 561 Goat anti-rat | Invitrogen | A-11077 | secondary antibody |
| DAPI | Biotium | 40043 | visualizes DNA |
| mouse antibody against b3-tubulin (TuJ-1) | Neuromics | MO15013 | early stage neuronal marker |
| rat antibody against CTIP2 | Abcam | ab18465 | layer 5/6 cortical neurons |
| chicken antibody against MAP2 | LifeSpan Biosciences | LS-B290 | early stage neuronal marker |
| chicken antibody against NeuN | Millipore | ABN91 | late stage neuronal marker |
| rabbit antibody against MAP2 | Shelley Halpain | N/A | early stage neuronal marker |
| mouse antibody against PSD-95 | Sigma | P-246 | post-synaptic marker |
| rabbit antibody against Synapsin 1 | Millipore | AB1543 | pre-synaptic marker |
| Bovine serum albumin (BSA) | GE Healthcare Life Sciences | SH30574.02 | 10% in PBS for blocking |
| Titon X-100 | Sigma | 9002931 | Dilute to 0.2% on PBS for permeabilization |
| Viability Markers | |||
| Vivafix 649/660 | Biorad | 135-1118 | cell death marker |
| Calcium Imaging | |||
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| AAV8-syn-jGCAMP7f-WPRE | THE SALK INSTITUTE, GT3 Core Facility | N/A | calcium reporter in a viral delivery system |
| hiPSC-derived NPCs | |||
| WT 126 (Y2610) | Gage lab | N/A | Marchetto et al., 2010 |
| CVB WT24 | Yeo and Goldstein labs | N/A | unpublished |
References
- Engel, M., Do-Ha, D., Munoz, S. S., Ooi, L. Common pitfalls of stem cell differentiation: a guide to improving protocols for neurodegenerative disease models and research. Cell and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3693-3709 (2016).
- Kim, D. S., Ross, P. J., Zaslavsky, K., Ellis, J. Optimizing neuronal differentiation from induced pluripotent stem cells to model ASD. Frontiers in Cellular Neuroscience. 8, 109 (2014).
- Amin, N. D., Paşca, S. P. Building Models of Brain Disorders with Three-Dimensional Organoids. Neuron. 100 (2), 389-405 (2018).
- Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Passaging Cells. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Langdon, S. P. . Cancer Cell Culture. , (2010).
- Picot, J. . Human Cell Culture Protocols. 107, (2005).
- Marchetto, M. C., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks. Nature Protocols. 7 (10), 1836-1846 (2012).
- Banker, G., Goslin, K. Developments in neuronal cell culture. Nature. 336 (6195), 185-186 (1988).
- Calabrese, B., Halpain, S. Essential role for the PKC target MARCKS in maintaining dendritic spine morphology. Neuron. 48 (1), 77-90 (2005).
- Mullen, R. J., Buck, C. R., Smith, A. M. NeuN, a neuronal specific nuclear protein in vertebrates. Development. 116 (1), 201-211 (1992).
- Calabrese, B., Saffin, J. M., Halpain, S. Activity-dependent dendritic spine shrinkage and growth involve downregulation of cofilin via distinct mechanisms. PLOS One. 9 (4), 94787 (2014).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biology. 7 (10), 100 (2006).
- Gupta, S., et al. Deriving Dorsal Spinal Sensory Interneurons from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 10 (2), 390-405 (2018).
- Ogura, T., Sakaguchi, H., Miyamoto, S., Takahashi, J. Three-dimensional induction of dorsal, intermediate and ventral spinal cord tissues from human pluripotent stem cells. Development. 145, (2018).
- Playne, R., Jones, K., Connor, B. Generation of dopamine neuronal-like cells from induced neural precursors derived from adult human cells by non-viral expression of lineage factors. Journal of Stem Cells and Regenerative Medicine. 14 (1), 34-44 (2018).
- Rao, M. S., et al. Illustrating the potency of current Good Manufacturing Practice-compliant induced pluripotent stem cell lines as a source of multiple cell lineages using standardized protocols. Cytotherapy. 20 (6), 861-872 (2018).
- Suga, H. Differentiation of pluripotent stem cells into hypothalamic and pituitary cells. Neuroendocrinology. 101 (1), 18-24 (2015).
- Endaya, B., et al. Isolating dividing neural and brain tumour cells for gene expression profiling. Journal of Neuroscience Methods. 257, 121-133 (2016).
- Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. Journal of Neuroscience Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
- Frega, M., et al. Rapid Neuronal Differentiation of Induced Pluripotent Stem Cells for Measuring Network Activity on Micro-electrode Arrays. Journal of Visualized Experiments. (119), e54900 (2017).
- Grainger, A. I., et al. In vitro Models for Seizure-Liability Testing Using Induced Pluripotent Stem Cells. Frontiers in Neuroscience. 12, 590 (2018).
- Daub, A., Sharma, P., Finkbeiner, S. High-content screening of primary neurons: ready for prime time. Current Opinion in Neurobiology. 19 (5), 537-543 (2009).
