تحويل الخلايا الجذعية مستحث البشرية المستحثة (iPSCs) في العمود الفقري الوظيفي الشوكي والجمجمة الحركية باستخدام متجات البكالوريا
Summary
يسمح هذا البروتوكول بالتحويل السريع والفعال للخلايا الجذعية مستحث المستحثة إلى الخلايا العصبية الحركية ذات الهوية الشوكية أو الجمجمة ، عن طريق التعبير البعيد عن عوامل النسخ من ناقلات الحمل المحبله.
Abstract
ونحن نقدم هنا وصفا لطريقه للحصول علي الخلايا العصبية الحركية العمود الفقري والجمجمة الوظيفية من المستحث البشرية المستحثة (iPSCs). يتم الحصول علي التحويل المباشر إلى الخلايا العصبية الحركية عن طريق التعبير عن الوحدات البديلة لعوامل النسخ ، وهي Ngn2 ، Isl1 و Lhx3 (NIL) أو Ngn2 ، Isl1 و Phox2a (خطه البرامج الخاصة). وتحدد هذه الخطة ، علي التوالي ، هويه الخلايا العصبية للمحركات الشوكية والجمجمة. يبدا البروتوكول الخاص بنا بإنشاء خطوط iPSC المعدلة التي يتم فيها دمج الصفر أو النعناع البشري بشكل ثابت في الجينوم عن طريق ناقل ترانسباك. ثم يتم الحث علي التعبير عن الجينات عبر الدوكسيسيكلين ويؤدي ، في 5 أيام ، إلى تحويل iPSCs إلى المبتدئين MN. النضج اللاحق ، لمده 7 أيام ، يؤدي إلى السكان متجانسة من MNs الشوكي أو القحفيه. طريقتنا يحمل العديد من المزايا علي البروتوكولات السابقة: انها سريعة للغاية ومبسطه. انها لا تتطلب العدوى الفيروسية أو مزيد من العزلة MN; فانه يسمح توليد مختلف السكان الفرعيين MN (العمود الفقري والجمجمة) مع درجه ملحوظة من النضج ، كما يتضح من القدرة علي إطلاق النار القطارات من إمكانات العمل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الحصول علي عدد كبير من الخلايا العصبية الحركية دون تنقيه من السكان المختلطة. ويمكن استخدام الخلايا العصبية المستمدة من iPSC العمود الفقري والجمجمة الحركية في النمذجة في المختبر من التصلب الجانبي الضموري والامراض العصبية الأخرى من الخلايا العصبية الحركية. وقد تمثل الخلايا العصبية الحركية المتجانسة موردا هاما لفحوصات المخدرات الخاصة بنوع الخلية.
Introduction
العصبية الحركية (MN) انحطاط يلعب دورا مسببا في الامراض البشرية مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) وضمور العضلات الشوكي (SMA). ويعد إنشاء نظم نموذجيه للخلايا المختبرية المناسبة تلخص تعقيدات المليون البشري خطوه هامه نحو وضع نهج علاجيه جديده. الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (ipscs) ، والتي هبت مع خصائص تمايز التعددية الرائعة ، قد تم اشتقاقها الآن من عدد من المرضي المصابين بامراض الخلايا العصبية الحركية1،2. وقد تم توليد خطوط iPSC اضافيه تحمل طفرات المسببة للامراض المرتبطة بامراض MN عن طريق تحرير الجينات ، بدءا من السيطرة “صحية” مستحث الخلايا الجذعية3. وتمثل هذه الخطوط أدوات مفيده لنمذجة الامراض في المختبر وفحص المخدرات ، شريطه توافر الأساليب المناسبة لتمايز iPSC في MNs. والأساس المنطقي وراء تطوير هذه الطريقة هو تزويد المجتمع العلمي المهتم بامراض MN ببروتوكول تفاضلي سريع وفعال يؤدي إلى MNs وظيفية ناضجه. الميزة الاولي لهذا الأسلوب هو الإطار الزمني للتنفيذ. نقطه أخرى ذات صله من قوه ياتي من القضاء علي اي خطوه تنقيه. وأخيرا ، يمكن استخدام البروتوكول لتوليد اثنين من السكان متميزة من الخلايا العصبية الحركية.
امكانيه توليد أنواع فرعيه مختلفه من MNs هي ذات الصلة بشكل خاص لنمذجة امراض MN. ليس كل الأنواع الفرعية MN عرضه بنفس القدر في ALS و SMA وظهور الاعراض في وحدات المحركات المختلفة يؤثر بشكل كبير علي التكهن. في ALS, بداية العمود الفقري مع اعراض بدءا من الأطراف العلوية والسفلية يؤدي إلى الموت في حوالي 3-5 سنوات4. علي العكس من ذلك ، بداية بولبار ، بدءا من انحطاط MNs القحفيه ، لديه اسوا تكهن. وعلاوة علي ذلك ، فان النسبة المئوية لبداية بولبار اعلي بكثير في المرضي الذين يعانون من طفرات في البروتينات الريبية النيبالية ملزمه TDP-43 من الافراد الذين يعانون من طفرات SOD15. يعتمد تقريبا مجموع بروتوكولات التمايز MN البديلة علي نشاط حمض الريتينويك (RA) ، الذي يضفي علي الحرف الفقري التفريق بين ipscs6،7،8. وهذا يحد من امكانيه دراسة العوامل الجوهرية ، التي يمكن ان تكون وقائية في الأنواع الفرعية المحددة من الملايين9،10.
وتمشيا مع العمل السابق في الخلايا الجذعية الجنينية الفئران11, وقد أظهرنا مؤخرا ان في الإنسان ipscs التعبير عن Ngn2, Isl1 و LHX3 (NIL) يدفع هويه العمود الفقري MN, في حين ان Ngn2 و Isl1 زائد Phox2a (الخطة الخاصة) تحديد الجمجمة MNs12. التالي قمنا بتطوير بروتوكول فعال ، مما يؤدي إلى إنتاج MNs البشرية التي وهبها خصائص وظيفية في تحول 12 يوما. والغرض من هذه الطريقة هو الحصول ، في اطار زمني قصير ودون الحاجة إلى تنقيه (علي سبيل المثال ، من قبل FACS) ، والسكان الخلايا المخصبة للغاية ل MNs مع العمود الفقري أو الجمجمة الهوية.
Protocol
Representative Results
Discussion
يسمح هذا البروتوكول بتحويل iPSCs البشرية بكفاءة إلى الخلايا العصبية الحركية في العمود الفقري والجمجمة بفضل التعبير المنتبائي لعوامل النسخ الخاصة بالنسب. هذه الجينات هي محفزه من قبل الدوكسيسيكلين ومتكاملة بشكل ثابت في الجينوم بفضل ناقلات المستندة إلى ترانسباك. في المجموعات السكانية المخت?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويود المؤلفون ان يشكروا مرفق التصوير في مركز علوم النانو الحياتية ، المعهد الإيطالي لتقنيات التكنولوجيا ، للحصول علي الدعم والمشورة الفنية. ونحن ممتنون لأعضاء مركز العلوم نانو الحياة لمناقشه مفيده. وكان هذا العمل مدعوما جزئيا بمنحه من AriSLA (منحه تجريبية 2016 “ستريسفوس”) إلى AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
