Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac

Summary

Este protocolo permite a conversão rápida e eficiente de pilhas de haste pluripotentes induzidas em neurônios de motor com uma identidade espinal ou craniana, pela expressão ectópica de fatores da transcrição dos vetores induzível de piggybac.

Abstract

Nós descrevemos aqui um método para obter os neurônios de motor espinal e craniano funcionais das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs). A conversão direta no neurônio motor é obtida por expressão ectópica de módulos alternativos de fatores de transcrição, ou seja, Ngn2, Isl1 e Lhx3 (Nil) ou Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). Nil e Nip especificam, respectivamente, a identidade da coluna vertebral e do neurônio motor craniano. Nosso protocolo começa com a geração de linhas iPSC modificadas nas quais NIL ou NIP estão estavelmente integrados no genoma através de um vetor de Transposon piggyBac. A expressão dos transgenes é então induzida por doxiciclina e leva, em 5 dias, à conversão de iPSCs em progenitores MN. A maturação subsequente, por 7 dias, leva a populações homogêneas de MNs espinhais ou cranianos. Nosso método tem várias vantagens em relação aos protocolos anteriores: é extremamente rápido e simplificado; Não requer infecção viral ou mais isolamento MN; permite gerar diferentes subpopulações de MN (espinal e craniana) com um grau notável de maturação, como demonstrado pela capacidade de disparar trens de potenciais de ação. Além disso, um grande número de neurônios motores pode ser obtido sem purificação de populações mistas. os neurônios de motor espinal e craniano derivado de IPSC podem ser usados para in vitro a modelagem da esclerose lateral amyotrophic e de outras doenças neurodegenerativas do neurônio de motor. Populações de neurônios motores homogêneos podem representar um recurso importante para a triagem de drogas específicas do tipo celular.

Introduction

A degeneração do neurônio motor (MN) desempenha um papel causador nas doenças humanas, como a esclerose lateral amiotrófica (ALS) e a atrofia muscular espinhal (SMA). O estabelecimento de sistemas de modelos celulares in vitro adequados, que recapitulam a complexidade do MN humano, é um passo importante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que são dotadas de notáveis Propriedades de diferenciação plurilinhagem, já foram derivadas de um número de pacientes acometidos por doenças do neurónios motores^1,2. Linhas adicionais de iPSC portadores de m....

Protocol

1. manutenção de iPSCs humanos

1. Preparação de placas revestidas com matriz
   1. Descongelar um frasco de 5 mL de matriz (ver tabela de materiais) a 4 ° c durante a noite. Os estoques originais da matriz vêm em concentrações de estoque diferentes e as alíquotas são feitas de acordo com o fator de diluição indicado na folha de dados, específico para o lote individual. É importante manter o tubo de ensaio e os tubos frios para evitar o gelamento prematuro da matriz. Distribua a matriz em alíquotas em crimpetes pré-refrigerados no gelo. Congelar alíquotas não utilizadas a-20 ° c.
   2. Coloque uma alíquota no gelo por ....

Results

Uma descrição esquemática do método de diferenciação é mostrada na Figura 1. Os iPSCs humanos (linha³do peso I) foram transfected com EPB-BSD-TT-nil ou EPB-BSD-TT-NIP, gerando, em cima da seleção do blasticidina, linhas de pilha estáveis e induzível¹², doravante referidas como IPSC-nil e IPSC-NIP, respectivamente. As células diferenciadoras foram caracterizadas para a expressão do marcador de pluripotência OCT4 e do marcador Pan-neuronal TUJ1. .......

Discussion

Este protocolo permite converter eficientemente iPSCs humanos em neurônios de motor espinal e craniano agradecimentos à expressão ectópica de factores linhagem-específicos da transcrição. Estes transgenes são induzível pelo doxiciclina e integrados estàvel no genoma agradecimentos a um vetor Transposon-baseado de piggybac. Em uma população mista, uma ou várias cópias do vetor piggyBac serão aleatoriamente integradas ao genoma de células individuais, aumentando o risco de alterações na integridade do genoma. Além disso, u.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Bapta	Sigma-Aldrich	A4926-1G	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-100ML	Reagente de dissociação celular
anti-CHAT	EMD Millipore	AB144P	Anti-colina acetiltransferase. Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. RRID: AB_2079751; Número do lote: 2971003
anti-cabra Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A11055	Anticorpo secundário usado para ensaios de immonofluorescência. RRID: AB_2534102; Número do lote: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647	Thermo Fisher Scientific	A31571	Anticorpo secundário usado para ensaios de immonofluorescência. RRID: AB_162542; Número do lote:
1757130 anti-Oct4	BD Biosciences	611202	Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. RRID: AB_398736; Número de lote: 5233722
anti-Phox2b	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	sc-376997	Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. Número do lote: E0117
anti-coelho Alexa Fluor 594	Ciências Imunológicas	IS-20152-1	Anticorpo secundário usado para ensaios de imunofluorescência
anti-TUJ1	Sigma-Aldrich	T2200	Anticorpo primário usado em ensaios de imunocoloração. RRID: AB_262133
B27	Miltenyi Biotec	130-093-566	Suplemento livre de soro para manutenção de células neuronais
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Meio de congelamento celular, usado aqui para progenitores de neurônios motores
BDNF	PreproTech	450-02	Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro
Blasticidina	Sigma-Aldrich	203350	Antibiótico nucleosídeo que inibe a síntese de proteínas em procariontes e eucariotos
BSA	Sigma-Aldrich	A2153	Albumina de soro bovino. Agente bloqueador para evitar a ligação não específica de anticorpos em ensaios de imunocoloração
CaCl2	Sigma-Aldrich	C3881	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Software Clampex 10	Dispositivos	moleculares Clampex 10	Sistema de registro de correntes de membrana
Corning Matrigel qualificado por hESC Matriz	Corning	354277	Preparação da membrana basal reconstituída a partir do sarcoma de camundongo Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Usado para adesão de iPSC a suportes de plástico e vidro
CRYOSTEM ACF CONGELAMENTO MÍDIA	Biological Industries	05-710-1E	Meio de congelamento para iPSCs humanos
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G5146	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
DAPI pó	Roche	10236276001	4′,6-diamidino-2-fenilindol Mancha fluorescente que se liga à adenina– regiões ricas em timina no DNA usadas para coloração de núcleos em ensaios de immonofluorescência
DAPT	AdipoGen	AG-CR1-0016-M005	Inibidor da gama secretase
Dispase	Gibco	17105-041	Reagente para dissociação suave de iPSCs humanas
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Meio basal para cultura de células
Doxiciclina	Sigma-Aldrich	D9891-1G& nbsp;	Usado para induzir a expressão de transgenes dos vetores epB-Bsd-TT-NIL e epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Linha iPSC humana comercial
E.Z.N.A Total RNA Kit	Omega bio-tek	R6834-02	Kit para extração total de RNA de células eucarióticas cultivadas
GDNF	PreproTech	450-10	Fator Neurotrófico Derivado de Glial
Gibco Linha HiPSC Episomal	Thermo Fisher Scientific	A18945	Linha iPSC humana comercial
Glutamax	Thermo Fisher Scientific	35050038	Uma alternativa à L-glutamina com maior estabilidade. Melhora a saúde celular.
Hepes	Sigma-Aldrich	H4034	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
iScript Transcrição Reversa Supermix para RT-qPCR	Kit de 1708841 Bio-Rad		para análise de expressão gênica usando qPCR em tempo real
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix	Bio-Rad	172-5121	Master mix de reação pronto para uso otimizado para PCR quantitativo baseado em corante (qPCR) em qualquer instrumento de PCR em tempo real
Produtos químicos K-Gluconato	Sigma-Aldrich	G4500	para soluções eletrofisiológicas
Produtos químicos KCl	Sigma-Aldrich	P9333	para soluções eletrofisiológicas
Ácido L-ascórbico	LKT Laboratories	A7210	Usado em cultura de células como antioxidante
Laminina	Sigma-Aldrich	11243217001	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
Microscópio confocal de varredura a laser	Olympus	iX83 FluoView1200	Microscópio confocal para aquisição de imagens de imunocoloração
Mg-ATP	Sigma-Aldrich	A9187	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
Meio de montagem	Ibidi	50001	Solução de montagem utilizada para ensaios de microscopia confocal e imunofluorescência
Amplificador de grampo de remendo multiclamp	Molecular Devices	700B	Sistema de registo de correntes de membrana
Na-GTP	Sigma-Aldrich	G8877	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
NaCl	Sigma-Aldrich	71376	produtos químicos para soluções eletrofisiológicas
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Aminoácidos Não Essenciais. Usado como suplemento para meio de cultura celular, para aumentar o crescimento e a viabilidade celular.
Neon 100 μ Kit	L Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Kit de eletroporação de células
Neon Sistema de transfecção	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Sistema de eletroporação de células
Meio neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Meio basal projetado para manutenção e maturação de longo prazo de populações de células neuronais sem a necessidade de uma camada alimentadora de astrócitos
NutriStem-XF/FF	Biological Industries	05-100-1A	Meio de cultura iPSC humano
Paraformaldeído	Microscopia Eletrônica Sciences	157-8	Usado para fixação celular em ensaios de imunocoloração
PBS	Sigma-Aldrich	D8662-500ML	Tampão de fosfato de Dulbecco Salino, com cálcio, com magnésio
PBS Ca2+/Mg2+ livre	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampão de Fosfato Dulbecco's Saline, sem Cálcio, sem
Penicilina/Estreptomicina de Magnésio	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Solução de penicilina/estreptomicina usada para prevenir a contaminação da cultura de células por bactérias.
poli-ornitina	Sigma-Aldrich	P4957	Promove a fixação e o crescimento de células neurais in vitro
SU5402	Sigma-Aldrich	SML0443-5MG	Inibidor seletivo do receptor 2 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-2)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	4-(1,1,3,3-Tetrametilbutil)fenil-polietilenoglicol,  t-Octylphenoxypolyetoxyethanol, Polietilenoglicol  éter terc-octilfenílico. Usado para permeabilização celular em ensaios de imunocoloração
Microscópio vertical	Microscópio Olympus	BX51VI	para gravação eletrofisiológica equipado com câmera CoolSnap Myo
Y-27632  (Inibidor de ROCK)	Enzo Life Sciences	ALX-270-333-M005	Inibidor seletivo permeável à célula da proteína quinase (ROCK) contendo bobina enrolada associada a Rho. Aumenta a sobrevivência do iPSC
μ-Slide 8 Well	Ibidi	80826	Suporte para alto– análise microscópica final de células fixas