Conversão de pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs) em neurônios de motor espinal e craniano funcionais usando vetores de PiggyBac
Summary
Este protocolo permite a conversão rápida e eficiente de pilhas de haste pluripotentes induzidas em neurônios de motor com uma identidade espinal ou craniana, pela expressão ectópica de fatores da transcrição dos vetores induzível de piggybac.
Abstract
Nós descrevemos aqui um método para obter os neurônios de motor espinal e craniano funcionais das pilhas de haste pluripotentes induzidas humanas (iPSCs). A conversão direta no neurônio motor é obtida por expressão ectópica de módulos alternativos de fatores de transcrição, ou seja, Ngn2, Isl1 e Lhx3 (Nil) ou Ngn2, Isl1 e Phox2a (NIP). Nil e Nip especificam, respectivamente, a identidade da coluna vertebral e do neurônio motor craniano. Nosso protocolo começa com a geração de linhas iPSC modificadas nas quais NIL ou NIP estão estavelmente integrados no genoma através de um vetor de Transposon piggyBac. A expressão dos transgenes é então induzida por doxiciclina e leva, em 5 dias, à conversão de iPSCs em progenitores MN. A maturação subsequente, por 7 dias, leva a populações homogêneas de MNs espinhais ou cranianos. Nosso método tem várias vantagens em relação aos protocolos anteriores: é extremamente rápido e simplificado; Não requer infecção viral ou mais isolamento MN; permite gerar diferentes subpopulações de MN (espinal e craniana) com um grau notável de maturação, como demonstrado pela capacidade de disparar trens de potenciais de ação. Além disso, um grande número de neurônios motores pode ser obtido sem purificação de populações mistas. os neurônios de motor espinal e craniano derivado de IPSC podem ser usados para in vitro a modelagem da esclerose lateral amyotrophic e de outras doenças neurodegenerativas do neurônio de motor. Populações de neurônios motores homogêneos podem representar um recurso importante para a triagem de drogas específicas do tipo celular.
Introduction
A degeneração do neurônio motor (MN) desempenha um papel causador nas doenças humanas, como a esclerose lateral amiotrófica (ALS) e a atrofia muscular espinhal (SMA). O estabelecimento de sistemas de modelos celulares in vitro adequados, que recapitulam a complexidade do MN humano, é um passo importante para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que são dotadas de notáveis Propriedades de diferenciação plurilinhagem, já foram derivadas de um número de pacientes acometidos por doenças do neurónios motores1,2. Linhas adicionais de iPSC portadores de mutações patogênicas associadas a doenças de MN foram geradas pela edição gênica, a partir do controle de células-tronco pluripotentes “saudáveis”3. Estas linhas representam ferramentas úteis para a modelagem in vitro da doença e a triagem de fármacos, desde que estejam disponíveis métodos adequados para a diferenciação de iPSC em MNs. A justificativa por trás do desenvolvimento deste método é fornecer à comunidade científica interessada em doenças MN com um protocolo de diferenciação rápido e eficiente, dando origem a MNs funcionais maduros. A primeira vantagem desse método é seu cronograma de execução. Outro ponto de força relevante vem da eliminação de qualquer etapa de purificação. Finalmente, o protocolo pode ser usado para gerar duas populações distintas de neurônios motores.
A possibilidade de gerar diferentes subtipos de MNs é particularmente relevante para a modelagem de doenças de MN. Nem todos os subtipos de MN são igualmente vulneráveis em ALS e SMA e o aparecimento de sintomas em diferentes unidades motoras influencia consideravelmente o prognóstico. No ALS, o início espinal com sintomas que começam em membros superiores e mais baixos conduz à morte em aproximadamente 3-5 anos4. Inversamente, o início bulbar, começando com a degeneração de MNs cranianos, tem um prognóstico mais mau. Além disso, a porcentagem do início bulbar é significativamente mais elevada nos pacientes com mutações nas proteínas do RNA-ligação FUS e TDP-43 do que nos indivíduos com mutações SOD15. Quase a totalidade dos protocolos alternativos de diferenciação de MN se baseia na atividade do ácido retinóico (ar), que confere um caráter espinhal para diferenciar iPSCs6,7,8. Isso limita a possibilidade de estudo de fatores intrínsecos, que podem ser protetores em subtipos específicos de Mn9,10.
Consistente com um trabalho precedente em pilhas de haste embrionárias do rato11, nós mostramos recentemente que na expressão ectópica dos iPSCs humanos de Ngn2, de Isl1 e de Lhx3 (Nil) induz uma identidade espinal do MN, quando Ngn2 e Isl1 mais Phox2a (NIP) especific MNScranianos 12. Desenvolvemos, portanto, um protocolo eficiente, levando à produção de MNs humanos dotados de propriedades funcionais em uma reviravolta de 12 dias. O objetivo deste método é obter, em um curto espaço de tempo e sem a necessidade de purificação (por exemplo, por FACS), populações de células altamente enriquecidas para MNs com identidade espinhal ou craniana.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo permite converter eficientemente iPSCs humanos em neurônios de motor espinal e craniano agradecimentos à expressão ectópica de factores linhagem-específicos da transcrição. Estes transgenes são induzível pelo doxiciclina e integrados estàvel no genoma agradecimentos a um vetor Transposon-baseado de piggybac. Em uma população mista, uma ou várias cópias do vetor piggyBac serão aleatoriamente integradas ao genoma de células individuais, aumentando o risco de alterações na integridade do gen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores desejam agradecer ao Imaging Facility do Center for Life nano Science, Istituto Italiano di tecnologia, por suporte e assessoria técnica. Nós somos gratos aos membros do centro para a ciência Nano da vida para a discussão útil. Este trabalho foi apoiado parcialmente por uma concessão de AriSLA (concessão piloto 2016 “StressFUS”) a AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
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