Summary

Преобразование индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) в функциональные спинномозговых и черепных двигательных нейронов с помощью переносчиков

Published: May 01, 2019
doi:

Summary

Этот протокол позволяет быстрое и эффективное преобразование индуцированных плюрипотентных стволовых клеток в моторные нейроны с спинномозговой или черепной идентичности, эктопическим выражением транскрипционных факторов из индуцированных векторных переносчиков.

Abstract

Мы описываем здесь метод для получения функциональных спинномозговых и черепных двигательных нейронов из индуцированных человеком плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs). Прямое преобразование в мотонейрона получено эктопическим выражением альтернативных модулей транскрипционных факторов, а именно Ngn2, Isl1 и Lhx3 (ноль) или Ngn2, Isl1 и Phox2a (НПВ). НОЛЬ и НПВ указывают, соответственно, спинной и черепной двигательной идентичности. Наш протокол начинается с генерации измененных линий iPSC, в которых ноль или НПВ прочно интегрированы в геном через переносчик транспона. Экспрессия трансгенов затем индуцируется доксициклин и приводит, в 5 дней, к преобразованию Ипмск в MN прародителей. Последующее созревание, в течение 7 дней, приводит к однородным популяциям спинного или черепного МНБ. Наш метод имеет ряд преимуществ по сравнению с предыдущими протоколами: он чрезвычайно быстрый и упрощенный; Он не требует вирусной инфекции или дальнейшей изоляции MN; Он позволяет генерировать различные МН субпопуляции (спинной и черепной) с замечательной степенью созревания, о чем свидетельствует способность стрелять поездов потенциалов действия. Кроме того, большое количество двигательных нейронов может быть получено без очистки от смешанных популяций. iPSC-производные спинномозговых и черепных двигательных нейронов может быть использовано для экстракорпорального моделирования боковой амиотрофического склероза и других нейродегенеративных заболеваний мотонейрона. Однородные популяции мотонейронов может представлять собой важный ресурс для клеток типа конкретных обследований наркотиков.

Introduction

Двигательные нейрона (MN) дегенерация играет причинную роль в человеческих заболеваний, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS) и спинальной мышечной атрофии (СМА). Создание подходящих в пробирке систем модели клеток, которые повторяют сложность человеческого MN является важным шагом на пути к разработке новых терапевтических подходов. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ипскс), наделенные замечательными дифференцированием, в настоящее время получены от ряда пациентов, страдающих заболеваниями моторных нейронов1,2. Дополнительные линии iPSC, несущие патогенные мутации, связанные с заболеваниями MN, генерируются путем редактирования генов, начиная с контроля «здоровых» плюрипотентных стволовых клеток3. Эти линии представляют собой полезные инструменты для моделирования в пробирке и скрининга лекарственных препаратов при условии, что имеются соответствующие методы дифференциации iPSC в МНБ. Обоснование развития этого метода заключается в том, чтобы обеспечить научное сообщество, заинтересованный в MN заболеваний с быстрым и эффективным протоколом дифференцировки, давая рост зрелой функциональной МНБ. Первым преимуществом этого метода является его таймфрейм исполнения. Другой соответствующий пункт прочности приходит от исключения любого шага очищения. Наконец, протокол может быть использован для создания двух различных популяций моторных нейронов.

Возможность генерации различных подтипов МНБ особенно актуальна для моделирования заболеваний MN. Не все подтипы MN одинаково уязвимы в ALS и СМА и появление симптомов в различных моторных единицах значительно влияет на прогноз. В ALS, спинного начала с симптомами, начиная с верхних и нижних конечностей приводит к смерти примерно в 3-5 лет4. И наоборот, булбарные начала, начиная с дегенерацией черепных МНБ, имеет наихудший прогноз. Более того, процент появления булбарного заболевания значительно выше у пациентов с мутациями в РНК-связывающих белках ФУС и TDP-43, чем у особей с SOD1 мутациями5. Почти совокупность альтернативных протоколов дифференциации MN опирается на активность ретиноевой кислоты (RA), которая наделяют спинного характера для дифференциации iPSCs6,7,8. Это ограничивает возможность изучения внутренних факторов, которые могут быть защитные в конкретных подтипов MN9,10.

В соответствии с предыдущей работы в мышке эмбриональных стволовых клеток11, мы недавно показали, что в человеческом iPSCs эктопического выражения Ngn2, Isl1 и LHX3 (ноль) индуцирует спинного MN идентичности, в то время как Ngn2 и Isl1 плюс PHOX2A (НПВ) определить черепной МНБ12. Поэтому мы разработали эффективный протокол, что привело к производству человека МНБ наделены функциональных свойств в 12 дней поворот. Цель этого метода заключается в получении, в короткие сроки и без необходимости очистки (например, по FACS), популяции клеток высоко обогащенный для МНБ с позвоночника или черепной идентичности.

Protocol

1. поддержание iPSCs человека Подготовка пластин с матрицей с покрытием Оттепель один 5 мл флакон матрицы (см. таблицу материалов) при температуре 4 °c в одночасье. Оригинальные запасы матрицы приходят на различные концентрации запасов и aliquототы производятся в…

Representative Results

Схематическое описание метода дифференциации показано на рисунке 1. IPSCs человека (ДЦ I линия3) были трансфедифицированна с ЭПБ-бзди-ТТ-Нил или ЭПБ-БЗД-ТТ-НПВ, генерируя, после того, как недоволен отбора, стабильной и индузбл ячейки линии12, далее им?…

Discussion

Этот протокол позволяет эффективно преобразовывать человеческие ИППО в спинномозговую и черепную двигательные нейроны благодаря эктопическим выражению специфических факторов, связанных с линией преемственности. Эти трансгены являются Индастри по доксициклин и стабильно интегриро…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотят поблагодарить центр визуализации в центре жизни нано науки, Isto Итальянский ди Текнологии, для поддержки и технических консультаций. Мы благодарны членам центра по жизни нано науки для полезной дискуссии. Эта работа была частично поддержана грантом Арисла (Пилотная субсидия 2016 “Стрессфус”) в AR.

Materials

5-Bapta Sigma-Aldrich A4926-1G chemicals for electrophysiological solutions
Accutase Sigma-Aldrich A6964-100ML  Cell dissociation reagent
anti-CHAT EMD Millipore  AB144P Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003
anti-goat Alexa Fluor 488  Thermo Fisher Scientific  A11055 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848
anti-mouse Alexa Fluor 647 Thermo Fisher Scientific  A31571 Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130
anti-Oct4  BD Biosciences 611202 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722
anti-Phox2b Santa Cruz Biotechnology, Inc. sc-376997 Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117
anti-rabbit Alexa Fluor 594  Immunological Sciences IS-20152-1 Secondary antibody used for immonofluorescence assays
anti-TUJ1  Sigma-Aldrich  T2200 Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133
B27 Miltenyi Biotec 130-093-566 Serum free supplement for neuronal cell maintenance
Bambanker Nippon Genetics NGE-BB02 Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors
BDNF PreproTech 450-02 Brain-Derived Neurotrophic Factor
Blasticidin Sigma-Aldrich 203350 Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes
BSA Sigma-Aldrich A2153 Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays
CaCl2 Sigma-Aldrich C3881 chemicals for electrophysiological solutions
Clampex 10 software Molecular Devices Clampex 10 Membrane currents recording system
Corning Matrigel hESC-qualified Matrix Corning 354277 Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports
CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA Biological Industries 05-710-1E Freezing medium for human iPSCs
D-Glucose Sigma-Aldrich G5146 chemicals for electrophysiological solutions
DAPI powder Roche 10236276001 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays
DAPT AdipoGen AG-CR1-0016-M005 Gamma secretase inhibitor
Dispase Gibco 17105-041 Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
DMEM/F12 Sigma-Aldrich D6421-500ML Basal medium for cell culture
Doxycycline Sigma-Aldrich D9891-1G  Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors
DS2U  WiCell UWWC1-DS2U Commercial human iPSC line
E.Z.N.A Total RNA Kit  Omega bio-tek R6834-02 Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells
GDNF PreproTech 450-10 Glial-Derived Neurotrophic Factor
Gibco Episomal hiPSC Line Thermo Fisher Scientific A18945 Commercial human iPSC line
Glutamax Thermo Fisher Scientific 35050038 An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health.
Hepes Sigma-Aldrich H4034 chemicals for electrophysiological solutions
iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR  Bio-Rad 1708841 Kit for gene expression analysis using real-time qPCR
iTaqTM Universal SYBR Green Supermix  Bio-Rad 172-5121  Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument
K-Gluconate Sigma-Aldrich G4500 chemicals for electrophysiological solutions
KCl Sigma-Aldrich P9333 chemicals for electrophysiological solutions
L-ascorbic acid LKT Laboratories A7210 Used in cell culture as an antioxidant
Laminin Sigma-Aldrich 11243217001 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Laser scanning confocal microscope  Olympus  iX83 FluoView1200 Confocal microscope for acquisition of immunostaining images
Mg-ATP Sigma-Aldrich A9187 chemicals for electrophysiological solutions
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 chemicals for electrophysiological solutions
Mounting Medium  Ibidi 50001 Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays
Multiclamp patch-clamp amplifier Molecular Devices 700B Membrane currents recording system
Na-GTP Sigma-Aldrich G8877 chemicals for electrophysiological solutions
NaCl Sigma-Aldrich 71376 chemicals for electrophysiological solutions
NEAA Thermo Fisher Scientific 11140035 Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability.
Neon 100 μL Kit Thermo Fisher Scientific MPK10096 Cell electroporation kit
Neon Transfection System Thermo Fisher Scientific MPK5000 Cell electroporation system
Neurobasal Medium Thermo Fisher Scientific 21103049 Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer
NutriStem-XF/FF  Biological Industries 05-100-1A Human iPSC culture medium
Paraformaldehyde Electron Microscopy Sciences 157-8 Used for cell fixation in immunostaining assays
PBS Sigma-Aldrich D8662-500ML Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium
PBS Ca2+/Mg2+ free Sigma-Aldrich D8537-500ML Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium
Penicillin/Streptomycin  Sigma-Aldrich P4333-100ML Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria.
poly-ornithine Sigma-Aldrich P4957 Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
SU5402 Sigma-Aldrich SML0443-5MG Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2)
Triton X-100  Sigma-Aldrich T8787 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays
Upright microscope Olympus BX51VI Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera 
Y-27632  (ROCK inhibitor) Enzo Life Sciences ALX-270-333-M005  Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival
μ-Slide 8 Well  Ibidi 80826 Support for high–end microscopic analysis of fixed cells

References

  1. Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
  2. Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
  3. Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
  4. Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
  5. Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
  6. Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
  7. Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
  8. Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
  9. Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
  10. Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
  11. Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
  12. De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
  13. Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
  14. Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
  15. Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
  16. Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
  17. Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
  18. Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
  19. Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
  20. Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
  21. Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
check_url/59321?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Garone, M. G., de Turris, V., Soloperto, A., Brighi, C., De Santis, R., Pagani, F., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Conversion of Human Induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) into Functional Spinal and Cranial Motor Neurons Using PiggyBac Vectors. J. Vis. Exp. (147), e59321, doi:10.3791/59321 (2019).

View Video