Omvandling av mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) till funktionella spinal och kranial motor neuron använda PiggyBac vektorer
Summary
Detta protokoll möjliggör snabb och effektiv omvandling av inducerade pluripotenta stamceller till motoriska nerv celler med en spinal eller kranial identitet, genom ektopisk uttryck av transkriptionsfaktorer från inducerbara piggyBac vektorer.
Abstract
Vi beskriver här en metod för att få funktionella spinal och kraniala motoriska nerv celler från humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs). Direkt omvandling till motor neuron erhålls genom ektopisk uttryck för alternativa moduler av transkriptionsfaktorer, nämligen Ngn2, Isl1 och Lhx3 (NIL) eller Ngn2, Isl1 och Phox2a (NIP). NIL och NIP specificera, respektive, spinal och kranial motor neuron identitet. Vårt protokoll börjar med generering av modifierade iPSC linjer där NIL eller NIP är stabilt integrerade i arvs massan via en piggyBac transposon vektor. Uttryck av transgenerna framkallas därefter av doxycyklin och blytak, i 5 dagar, till omvandlingen av iPSCs in i MN progenitors. Efterföljande mognad, för 7 dagar, leder till homogena populationer av spinal eller kranial MNs. Vår metod har flera fördelar jämfört med tidigare protokoll: det är extremt snabbt och förenklat; Det kräver inte virus infektion eller ytterligare MN-isolering; Det gör det möjligt att generera olika MN subpopulationer (spinal och kranial) med en anmärknings värd mognads grad, vilket framgår av förmågan att avfyra tåg av åtgärder potentialer. Dessutom kan ett stort antal motoriska nerv celler erhållas utan rening från blandade populationer. iPSC-härledda spinal och kranial motoriska nerv celler kan användas för in vitro-modellering av amyotrofisk lateral skleros och andra neurodegenerativa sjukdomar i motorn neuron. Homogena motor neuron populationer kan representera en viktig resurs för cell typ specifika drog screening.
Introduction
Motorisk neuron (MN) degeneration spelar en orsakande roll i mänskliga sjukdomar som amyotrofisk lateral skleros (ALS) och spinal muskelatrofi (SMA). Etablera lämpliga in vitro cell modell system som upprepa komplexiteten i den mänskliga mn är ett viktigt steg mot utvecklingen av nya terapeutiska metoder. Inducerade pluripotenta stamceller (ipscs), som är utrustade med anmärknings värda plurilineage differentiering egenskaper, har nu härletts från ett antal patienter som drabbats av motor neuron sjukdomar1,2. Ytterligare iPSC linjer redovisade patogena mutationer associerade till MN sjukdomar har genererats av gen redigering, från kontroll “friska” pluripotenta stamceller3. Dessa linjer representerar användbara verktyg för in vitro-modellering och drog screening, förutsatt att lämpliga metoder för iPSC differentiering i MNs finns tillgängliga. Logiken bakom utvecklingen av denna metod är att ge vetenskaps samfundet intresse rad av MN sjukdomar med en snabb och effektiv differentiering protokoll ger upphov till mogna funktionella MNs. Den första fördelen med denna metod är dess tidsram för utförande. En annan relevant punkt av styrka kommer från avskaffandet av varje renings steg. Slutligen kan protokollet användas för att generera två distinkta populationer av motoriska nerv celler.
Möjligheten att skapa olika subtyper av MNs är särskilt relevant för modellering av MN-sjukdomar. Inte alla mn under typer är lika sårbara i ALS och sma och uppkomsten av symtom i olika motoenheter påverkar kraftigt prognosen. I ALS, spinal debut med symtom som börjar i övre och nedre extremiteterna leder till döden i ca 3-5 år4. Omvänt, bulbar debut, börjar med degeneration av kranial MNs, har en värsta prognos. Dessutom är andelen bulbar debut signifikant högre hos patienter med mutationer i RNA-bindande proteiner FUS och TDP-43 än hos individer med SOD1 mutationer5. Nästan helheten av alternativa mn differentiering protokoll förlitar sig på aktiviteten av retinoinsyra syra (ra), som ger en spinal karaktär att differentiera ipscs6,7,8. Detta begränsar möjligheten att studera inneboende faktorer, som kan vara skyddande i specifika mn under typer9,10.
I överensstämmelse med ett tidigare arbete i mus embryonala stamceller11, har vi nyligen visat att i mänskliga ipscs ektopisk uttryck för Ngn2, Isl1 och LHX3 (Nil) inducerar en spinal mn identitet, medan Ngn2 och Isl1 plus PHOX2A (NiP) ange kranial mns12. Vi har därför utvecklat ett effektivt protokoll, som leder till produktion av mänskliga MNs begåvad med funktionella egenskaper i en 12 dagars vändning. Syftet med denna metod är att på kort tid och utan behov av rening (t. ex. av FACS) uppnå en cell population som är mycket berikad för MNs med spinal-eller kranialidentitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Detta protokoll gör det möjligt att effektivt omvandla mänskliga iPSCs i spinal och kranial motoriska nerv celler tack vare ektopisk uttryck för härstamning specifika transkriptionsfaktorer. Dessa transgener induceras av doxycyklin och stabilt integreras i arvs massan tack vare en piggyBac transposon-baserade vektor. I en blandad population kommer en eller flera kopior av piggyBac-vektorn att slumpmässigt integreras i enskilda cellers arvs massa, vilket ökar risken för förändringar av genomens integritet. Dessu…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna vill tacka Imaging Facility vid centrum för Life nano Science, Istituto Italiano di Tecnologia, för stöd och teknisk rådgivning. Vi är tacksamma till medlemmar i centrum för Life nano Science för hjälpsam diskussion. Detta arbete stöddes delvis av ett bidrag från AriSLA (pilot Grant 2016 “StressFUS”) till AR.
Materials
| 5-Bapta | Sigma-Aldrich | A4926-1G | chemicals for electrophysiological solutions |
| Accutase | Sigma-Aldrich | A6964-100ML | Cell dissociation reagent |
| anti-CHAT | EMD Millipore | AB144P | Anti-Choline Acetyltransferase. Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_2079751; Lot number: 2971003 |
| anti-goat Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_2534102; Lot number: 1915848 |
| anti-mouse Alexa Fluor 647 | Thermo Fisher Scientific | A31571 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays. RRID: AB_162542; Lot number: 1757130 |
| anti-Oct4 | BD Biosciences | 611202 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_398736; Lot number: 5233722 |
| anti-Phox2b | Santa Cruz Biotechnology, Inc. | sc-376997 | Primary antibody used in immunostaining assays. Lot number: E0117 |
| anti-rabbit Alexa Fluor 594 | Immunological Sciences | IS-20152-1 | Secondary antibody used for immonofluorescence assays |
| anti-TUJ1 | Sigma-Aldrich | T2200 | Primary antibody used in immunostaining assays. RRID: AB_262133 |
| B27 | Miltenyi Biotec | 130-093-566 | Serum free supplement for neuronal cell maintenance |
| Bambanker | Nippon Genetics | NGE-BB02 | Cell freezing medium, used here for motor neuron progenitors |
| BDNF | PreproTech | 450-02 | Brain-Derived Neurotrophic Factor |
| Blasticidin | Sigma-Aldrich | 203350 | Nucleoside antibiotic that inhibits protein synthesis in prokaryotes and eukaryotes |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2153 | Bovine Serum Albumin. Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C3881 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Clampex 10 software | Molecular Devices | Clampex 10 | Membrane currents recording system |
| Corning Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | Reconstituted basement membrane preparation from the Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mouse sarcoma. Used for adhesion of iPSC to plastic and glass supports |
| CRYOSTEM ACF FREEZING MEDIA | Biological Industries | 05-710-1E | Freezing medium for human iPSCs |
| D-Glucose | Sigma-Aldrich | G5146 | chemicals for electrophysiological solutions |
| DAPI powder | Roche | 10236276001 | 4′,6-diamidino-2-phenylindole. Fluorescent stain that binds to adenine–thymine rich regions in DNA used for nuclei staining in immonofluorescence assays |
| DAPT | AdipoGen | AG-CR1-0016-M005 | Gamma secretase inhibitor |
| Dispase | Gibco | 17105-041 | Reagent for gentle dissociation of human iPSCs |
| DMEM/F12 | Sigma-Aldrich | D6421-500ML | Basal medium for cell culture |
| Doxycycline | Sigma-Aldrich | D9891-1G | Used to induce expression of transgenes from epB-Bsd-TT-NIL and epB-Bsd-TT-NIP vectors |
| DS2U | WiCell | UWWC1-DS2U | Commercial human iPSC line |
| E.Z.N.A Total RNA Kit | Omega bio-tek | R6834-02 | Kit for total extraction of RNA from cultured eukaryotic cells |
| GDNF | PreproTech | 450-10 | Glial-Derived Neurotrophic Factor |
| Gibco Episomal hiPSC Line | Thermo Fisher Scientific | A18945 | Commercial human iPSC line |
| Glutamax | Thermo Fisher Scientific | 35050038 | An alternative to L-glutamine with increased stability. Improves cell health. |
| Hepes | Sigma-Aldrich | H4034 | chemicals for electrophysiological solutions |
| iScript Reverse Transcription Supermix for RT-qPCR | Bio-Rad | 1708841 | Kit for gene expression analysis using real-time qPCR |
| iTaqTM Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | Ready-to-use reaction master mix optimized for dye-based quantitative PCR (qPCR) on any real-time PCR instrument |
| K-Gluconate | Sigma-Aldrich | G4500 | chemicals for electrophysiological solutions |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | chemicals for electrophysiological solutions |
| L-ascorbic acid | LKT Laboratories | A7210 | Used in cell culture as an antioxidant |
| Laminin | Sigma-Aldrich | 11243217001 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | iX83 FluoView1200 | Confocal microscope for acquisition of immunostaining images |
| Mg-ATP | Sigma-Aldrich | A9187 | chemicals for electrophysiological solutions |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M8266 | chemicals for electrophysiological solutions |
| Mounting Medium | Ibidi | 50001 | Mounting solution used for confocal microscopy and immunofluorescence assays |
| Multiclamp patch-clamp amplifier | Molecular Devices | 700B | Membrane currents recording system |
| Na-GTP | Sigma-Aldrich | G8877 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71376 | chemicals for electrophysiological solutions |
| NEAA | Thermo Fisher Scientific | 11140035 | Non-Essential Amino Acids. Used as a supplement for cell culture medium, to increase cell growth and viability. |
| Neon 100 μL Kit | Thermo Fisher Scientific | MPK10096 | Cell electroporation kit |
| Neon Transfection System | Thermo Fisher Scientific | MPK5000 | Cell electroporation system |
| Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Basal medium designed for long-term maintenance and maturation of neuronal cell populations without the need for an astrocyte feeder layer |
| NutriStem-XF/FF | Biological Industries | 05-100-1A | Human iPSC culture medium |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 157-8 | Used for cell fixation in immunostaining assays |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8662-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w Calcium w Magnesium |
| PBS Ca2+/Mg2+ free | Sigma-Aldrich | D8537-500ML | Dulbecco s Phosphate Buffer Saline w/o Calcium w/o Magnesium |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333-100ML | Penicillin/Streptomicin solution used to prevent cell culture contamination from bacteria. |
| poly-ornithine | Sigma-Aldrich | P4957 | Promotes attachment and growth of neural cells in vitro |
| SU5402 | Sigma-Aldrich | SML0443-5MG | Selective inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR-2) |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | 4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether. Used for cell permeabilization in immunostaining assays |
| Upright microscope | Olympus | BX51VI | Microscope for electrophysiological recording equipped with CoolSnap Myo camera |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Enzo Life Sciences | ALX-270-333-M005 | Cell-permeable selective inhibitor of Rho-associated, coiled-coil containing protein kinase (ROCK). Increases iPSC survival |
| μ-Slide 8 Well | Ibidi | 80826 | Support for high–end microscopic analysis of fixed cells |
References
- Dimos, J. T., et al. Induced Pluripotent Stem Cells Generated from Patients with ALS Can Be Differentiated into Motor Neurons. Science (New York, NY). 321 (5893), 1218 (2008).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457 (7227), 277-280 (2009).
- Lenzi, J., et al. ALS mutant FUS proteins are recruited into stress granules in induced Pluripotent Stem Cells (iPSCs) derived motoneurons. Disease models & mechanisms. 8 (7), 755-766 (2015).
- Wijesekera, L. C., Leigh, P. N. Amyotrophic lateral sclerosis. Orphanet journal of rare diseases. 4 (3), 1-22 (2009).
- Yan, J., et al. Frameshift and novel mutations in FUS in familial amyotrophic lateral sclerosis and ALS/dementia. Neurology. 75 (9), 807-814 (2010).
- Boulting, G. L., et al. A functionally characterized test set of human induced pluripotent stem cells. Nature biotechnology. 29 (3), 279-286 (2011).
- Amoroso, M. W., et al. Accelerated high-yield generation of limb-innervating motor neurons from human stem cells. The Journal of neuroscience: the official journal of the Society for Neuroscience. 33 (2), 574-586 (2013).
- Maury, Y., et al. Combinatorial analysis of developmental cues efficiently converts human pluripotent stem cells into multiple neuronal subtypes. Nature biotechnology. 33 (1), 89-96 (2015).
- Allodi, I., et al. Differential neuronal vulnerability identifies IGF-2 as a protective factor in ALS. Scientific reports. 6, 25960 (2016).
- Kaplan, A., et al. Neuronal matrix metalloproteinase-9 is a determinant of selective neurodegeneration. Neuron. 81 (2), 333-348 (2014).
- Mazzoni, E. O., et al. Synergistic binding of transcription factors to cell-specific enhancers programs motor neuron identity. Nature neuroscience. 16 (9), 1219-1227 (2013).
- De Santis, R., Garone, M. G., Pagani, F., de Turris, V., Di Angelantonio, S., Rosa, A. Direct conversion of human pluripotent stem cells into cranial motor neurons using a piggyBac vector. Stem Cell Research. 29, 189-196 (2018).
- Yusa, K., Zhou, L., Li, M. A., Bradley, A., Craig, N. L. A hyperactive piggyBac transposase for mammalian applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (4), 1531-1536 (2011).
- Sances, S., et al. Modeling ALS with motor neurons derived from human induced pluripotent stem cells. Nature Neuroscience. 16 (4), 542-553 (2016).
- Miller, J. D., et al. Human iPSC-based modeling of late-onset disease via progerin-induced aging. Cell stem cell. 13 (6), 691-705 (2013).
- Lenzi, J., et al. Differentiation of control and ALS mutant human iPSCs into functional skeletal muscle cells, a tool for the study of neuromuscolar diseases. Stem Cell Research. 17 (1), 140-147 (2016).
- Zhang, Y., et al. Rapid Single-Step Induction of Functional Neurons from Human Pluripotent Stem Cells. Neuron. 78 (5), 785-798 (2013).
- Theka, I., et al. Rapid generation of functional dopaminergic neurons from human induced pluripotent stem cells through a single-step procedure using cell lineage transcription factors. Stem cells translational medicine. 2 (6), 473-479 (2013).
- Pawlowski, M., et al. Inducible and Deterministic Forward Programming of Human Pluripotent Stem Cells into Neurons, Skeletal Myocytes, and Oligodendrocytes. Stem Cell Reports. 8 (4), 803-812 (2017).
- Li, X., et al. Fast Generation of Functional Subtype Astrocytes from Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Reports. 11 (4), 998-1008 (2018).
- Nehme, R., et al. Combining NGN2 Programming with Developmental Patterning Generates Human Excitatory Neurons with NMDAR-Mediated Synaptic Transmission. Cell reports. 23 (8), 2509-2523 (2018).
