혈관 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 En Face 면역 형광 염색사용
Summary
여기서, 우리는 마우스 대인의 내피 세포를 직접 관찰하기 위해 면역형광 염색에 대한 프로토콜을 제시한다. 이 기술은 다른 흐름 패턴에서 내피 세포의 세포 및 분자 표현형을 연구하고 동맥 경화증의 발달에 유용합니다.
Abstract
내피형및 형태학에 있는 비정상적인 변경은 동맥 경화증의 병인에 있는 초기 사건으로 여겨져. 본래 내피의 직접적인 관찰은 기능 장애 내피 세포에서 세포 및 분자 사건을 이해하는 귀중한 정보를 제공 할 것이다. 여기에서, 우리는 과학자들이 손상되지 않은 내피 표면의 명확한 심상을 얻고 그 자리에서 분자 발현 패턴을 분석하는 것을 가능하게 하는 변형된 en face 면역형광 염색 기술을 기술합니다. 이 방법은 대공의 다른 부위에서 전체 내피 단층을 관찰하기위한 간단하고 신뢰할 수 있습니다. 이 기술은 특히 초기 단계에서 동맥 경화증의 병리생리학을 이해하는 유망한 도구가 될 수 있습니다.
Introduction
혈관 구조의 초기 변화는 주로 내피에서 시작되며, 이는 세포 간 단단한 접합 복합체와 함께 혈액과 혈관 벽 사이의선택적 장벽으로 기능합니다 1. 실질적인 증거는 내피 기능 조절에 혈류의 기계적 효과에 대한 중요한역할을 가리킵니다 2. 유체 전단 응력, 혈류에 의해 생성되는 마찰력, 상이한 혈관 부위의 특정 흐름 패러다임에 따라내피 세포 형태 및 기능을 차별화하여 형성한다 2,3. 죽상 경화성 병변은 동맥의 직선 세그먼트와 같은 꾸준한 흐름 (s-flow)의 영역과 비교하여 혈관 곡률, 흐름 분배기 및 분기 점과 같은 방해 된 혈류 (d-flow)의 부위에서 우선적으로 발생합니다. 따라서, 내피 형태와 분자 발현 패턴의 직접적인 관찰은 다양한 흐름 패러다임하에서 내피 세포의 구조적 및 기능적 표현형에 대한 중요한 통찰력을 제공해야합니다.
배양된 내피 세포는 유체 전단 스트레스, 주변 사이토카인, 세포 세포 또는 세포 외 매트릭스 상호작용의 충격의 손실로 인해 생체 내에서 부분적으로 수행되는 것처럼 실제 표현형을 발현하지 않을 수 있다. 이를 돕기 위해, 본래 내피 세포 단층은 고전적인 면역 조직 화학을 사용하여 횡절편에서 연구 될 수있다. 그러나, 내피 단층은 일반적으로 명확하게 관찰될 수 없을 정도로 얇고 깨지기 쉽습니다. En face 면역조직화학은 내피의 내벽을 관찰하는데 사용되어 왔지만, 내피가 쥐 나 토끼의 동맥 벽의 일부 또는 기본 조직에서 쉽게 벗겨지기 때문에 그 결과에 복잡하거나 불규칙합니다. 그 벽은 두꺼운,4,5를 장착됩니다 .
마우스 모델은 여러 면에서 다른 동물에 비해 상당한 장점을 갖는다. 여기에서, 우리는 C57BL/6 마우스에 있는 대동맥 아치 및 흉부 대동맥의 내피 세포를 분석하기 위하여 수정된 en face 면역 형광 기술을 채택합니다. 이러한 기술은 상이한 흐름 패턴의 내피 병리생리학을 연구하고 동맥경화증6,7,8,9,10의발달에 널리 사용되어 왔다. 이 방법을 통해 과학자들은 내피의 전체 표면을 명확하게 관찰하고 다른 유체 전단 응력 하에서 주어진 단백질의 발현 패턴을 비교할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
내피는 지질, 염증성 매개체 및 유체 전단 응력1,11,12를포함하는 수많은 프로테로겐성 인자에 노출된다. 이 소동에서 내피 세포를 직접 관찰하는 것은 부상 자극에 반응하여 세포 형태, 세포 간 접합부 및 분자 발현 패턴의 변화를 분석하는 특별한 이점을 제공한다.
이전 연구는 동맥 벽의 내피를 관찰하기 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (그랜트 번호 81670451, 81770430), 상하이 라이징 스타 프로그램 (그랜트 번호 17QA140300), 상하이 시 정부의 과학 기술위원회 (그랜트 번호)에 의해 지원되었다. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
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