Verwendung von En Face Immunofluoreszenz Färbung zur direkten Beobachtung von vaskulären Endothelzellen
Summary
Hier stellen wir ein Protokoll zur Immunfluoreszenzfärbung vor, um die Endothelzellen der Mausaorta direkt zu beobachten. Diese Technik ist nützlich, wenn der zelluläre und molekulare Phänotyp von Endothelzellen in verschiedenen Strömungsmustern und bei der Entwicklung von Arteriosklerose untersucht wird.
Abstract
Aberrante Veränderungen des endotheliaalen Phänotyps und der Morphologie gelten als Erste in der Pathogenese der Arteriosklerose. Die direkte Beobachtung des intakten Endothels liefert wertvolle Informationen zum Verständnis der zellulären und molekularen Ereignisse in den dysfunktionalen Endothelzellen. Hier beschreiben wir eine modifizierte En-Face-Immunfluoreszenz-Färbungstechnik, die es Wissenschaftlern ermöglicht, klare Bilder der intakten endotheliaalen Oberfläche zu erhalten und die Molekülexpressionsmuster vor Ort zu analysieren. Die Methode ist einfach und zuverlässig für die Beobachtung der gesamten endotheliale Monolayer an verschiedenen Stellen der Aorta. Diese Technik kann ein vielversprechendes Werkzeug sein, um die Pathophysiologie der Arteriosklerose zu verstehen, besonders in einem frühen Stadium.
Introduction
Die frühen Veränderungen in der Vaskulatur initiieren vor allem das Endothel, das als selektive Barriere zwischen Blut und Gefäßwand mit seinen interzellulären engen Kreuzungskomplexen1fungiert. Erhebliche Beweise deuten auf eine entscheidende Rolle für die mechanischen Auswirkungen des Blutflusses bei der Modulation der Endothelfunktion2hin. Fluidscherspannung, eine Reibungskraft, die durch den Blutfluss erzeugt wird, formt die Endothelzellmorphologie und -funktion differenziell, abhängig von den spezifischen Strömungsparadigmen an verschiedenen Gefäßstellen2,3. Atherosklerotische Läsionen treten bevorzugt an Stellen gestörten Blutflusses (d-Flow), wie Gefäßkrümmungen, Strömungsteiler und Verzweigungspunkte, im Vergleich zu Regionen mit stetigem Fluss (s-Flow), wie dem geraden Segment der Arterie. Daher sollte die direkte Beobachtung der endotheliaalen Morphologie und Molekülexpressionsmuster wichtige Einblicke in die strukturellen und funktionellen Phänotypen von Endothelzellen unter unterschiedlichen Strömungsparadigmen liefern.
Kultivierte Endothelzellen exprimieren möglicherweise nicht den eigentlichen Phänotyp, wie sie es in vivo tun, teilweise aufgrund des Verlusts von Auswirkungen von Fluidscherspannung, umgebenden Zytokinen und Zellzell- oder Zell-Extrazellmatrix-Wechselwirkungen. Um dies zu unterstützen, kann die intakte Endothelzellmonoschicht mit klassischer Immunhistochemie an Querabschnitten untersucht werden. Die endotheliale Monoschicht ist jedoch so dünn und zerbrechlich, dass sie in der Regel nicht eindeutig beobachtet werden kann. En Face Immunohistochemistry wurde verwendet, um die innere Oberfläche des Endothel zu beobachten, ist aber entweder kompliziert oder erratisch in seinen Ergebnissen, weil das Endothel leicht aus dem darunter liegenden Gewebe entfernt wird, oder nur ein Teil der arteriellen Wand von Ratten oder Kaninchen, deren Wände dick sind, istmontiert 4,5.
Mausmodelle haben in vielerlei Hinsicht erhebliche Vorteile gegenüber anderen Tieren. Hier verwenden wir eine modifizierte En-Face-Immunfluoreszenz-Technik, um Endothelzellen des Aortenbogens und der Thoraxaorta in c57BL/6 Maus zu analysieren. Eine solche Technik wurde weit verbreitet, um die endotheliale Pathophysiologie in verschiedenen Strömungsmustern und in der Entwicklung von Arteriosklerose6,7,8,9,10zu studieren. Diese Methode ermöglicht es Wissenschaftlern, die gesamte Oberfläche des Endothels klar zu beobachten und die Expressionsmuster eines bestimmten Proteins in Regionen unter unterschiedlicher Fluidscherspannung zu vergleichen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das Endothel ist zahlreichen proatherogen Faktoren ausgesetzt, einschließlich Lipiden, Entzündungsmediatoren und Flüssigkeitsscherspannung1,11,12. Die direkte Beobachtung von Endothelzellen vor Ort bietet die besonderen Vorteile, Veränderungen in der Zellmorphologie, interzellulären Knoten und Molekülexpressionsmustern als Reaktion auf die Verletzungsreize zu analysieren.
Frühere Studien haben …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81670451, 81770430), dem Shanghai Rising-Star Program (Grant No. 17QA1403000) und dem Science Technology Committee der Shanghai Municipal Government (Grant No. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
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