Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לצביעת התאים. האנדותל של בית העורקים של העכבר ישירות טכניקה זו שימושית כשאתה לומד את הפנוטיפים הסלולאריים והמולקולריים של תאי האנדותל בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח טרשת עורקים.
Abstract
שינויים משתנים בעזרת המבנה האנדותל והורפולוגיה נחשבים לאירועים ראשוניים בפתוגנזה של טרשת עורקים. התבוננות ישירה של האנדותל ללא שינוי תספק מידע רב ערך להבנת האירועים הסלולאריים והמולקולריים בתאי האנדותל הלקוי. כאן, אנו מתארים שונה en הפנים אימונוofor, מכתים הטכניקה המאפשרת למדענים לקבל תמונות ברורות של משטח האנדותל שלמים ולנתח את דפוסי ביטוי המולקולה באתרו. השיטה היא פשוטה ואמינה להתבוננות במערך האנדותל השלמה באתרים שונים של העורקים. טכניקה זו עשויה להיות כלי מבטיח להבנת הפתופסולוגיה של טרשת עורקים, במיוחד בשלב מוקדם.
Introduction
השינויים המוקדמים בכלי הקיבול מפעילים בעיקר את האנדותל, המתפקד כמכשול סלקטיבי בין הדם לקיר הכלי עם הjunctional מתחמים1. ראיות משמעותיות מצביעות על תפקיד קריטי עבור ההשפעות המכאניות של זרימת הדם בפונקציה אנדותל מודולאל2. נוזל הטיית מתח, כוח מתפורר שנוצר על ידי זרימת הדם, צורות דיפרנציאלי של תא מורפולוגיה ותפקוד, בהתאם לתבניות הזרימה הספציפיות באתרי כלי דם שונים2,3. נגעים טרשת עורקים המועדפת מתרחשים באתרים של זרימת דם מופרעת (d-זרימה), כגון כלי עקמומיות, מפרידי זרימה, נקודות הסתעפות, לעומת אזורים של זרימה יציבה (s-flow), כגון קטע ישר של העורק. לפיכך, התבוננות ישירה בדפוסי הביטוי ובביטויים של המולקולה צריכה לספק תובנות חשובות לפנוטיפים הקונסטרוקטיבי והפונקציונליים של תאי האנדותל באמצעות תבניות זרימה משתנות.
תאים אנדותל מתורבת לא יכול לבטא את הפנוטיפים בפועל כפי שהם עושים ב vivo בחלקו עקב אובדן ההשפעה של מתח להטות את הנוזלים, ציטוקינים המקיפים, תא תא או אינטראקציות תא מטריצה. כדי לסייע בכך, ניתן לחקור את המונאולייר השלם של תא האנדותל בסעיפים רוחבי באמצעות אימונוהיסטוכימיה קלאסית. עם זאת, מונאולייר האנדותל הוא כה דק ושברירי שבדרך כלל לא ניתן להבחין בו בבהירות. En הפנים אימונוהיסטוכימיה שימש להתבונן במשטח הפנימי של האנדותל אבל הוא מסובך או בלתי יציב בתוצאותיה, כי האנדותל הוא הסיר בקלות מן הרקמה הבסיסית, או רק חלק של קיר העורקים של חולדות או ארנבים, הקירות שלהם עבים, מותקן4,5.
לדגמי עכבר יש יתרונות ניכרים על פני בעלי חיים אחרים במובנים רבים. כאן, אנו מעסיקים שונה en הפנים הטכניקה החיסונית לנתח את תאי האנדותל של קשת אבי העורקים ואת בית האבי החזה ב C57BL/6 העכבר. טכניקה כזאת שימש רבות כדי לחקור את האנדותל הפתופסולוגיה בדפוסי זרימה שונים ובפיתוח של טרשת עורקים6,7,8,9,10. שיטה זו מאפשרת למדענים להתבונן בכל פני השטח של האנדותל באופן ברור ולהשוות את דפוסי הביטוי של חלבון מסוים באזורים מתחת למתחים שונים של הטיה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ניסויי החיות נערכו בהתאם לפרוטוקולים הניסיוניים שאושרו על-ידי הוועדה למשאבי בעלי חיים של אוניברסיטת ג'יאו טונג שאנגחאי.
1. perfusion של העורקים של העכבר
- בקצרה, להפחית 12-שבוע בן C57BL/6 עכברים עם זריקות תוך הצפק של נתרן פנטוברביטל (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף). אשר בעדינות את הזנב מההרדמה.
הערה: אם לא נצפתה תנועה, החיה מורדם במידה מספקת כדי להתחיל בניסויים. - להקליט את כפות העכבר לערימת מגבות נייר עם קלטות דבק.
- להחזיק את העור של העכבר עם מלקחיים ולחתוך את העור עם זוג מספריים מהבטן אל החלק העליון של בית החזה.
- פתח את חלל הבטן מתחת לצלעות עם זוג מספריים חדים.
- הרם את עצם החזה עם מלקחיים וחתוך את הסרעפת; אז, לחתוך את הצלעות כדי לחשוף את חלל החזה.
- , תחתוך את הוריד-כרוב מעל הכבד. עם מספריים
- מבשם הלחץ (100 mmHg) עץ העורקים עבור 5 דקות עם מלוחים רגיל מקורר המכיל 40 יחידות/mL הפרין דרך החדר השמאלי עד הריאות והכבד להיות חיוור. לאחר מכן, מבשם עם מקורר 4% פאראפורמלדהיד ב פוספט מאגור מלוחים (PBS, pH 7.4) עבור 3 דקות.
- הסירו את כל השרירים, האיברים. והשומן עד שהעורקים ייחשפו
- הניחו את העכבר תחת מיקרוסקופ מבתר.
2. חיתוך ופתיחה longitudinally של העורקים
- לחשוף את העורקים בבירור תחת מיקרוסקופ מבתר ולהסיר את רקמות החיבור לאורך העורקים נקי ככל האפשר, עם מלקחיים עדינים זוג מספריים עדינים (איור 1).
- לנתח את העורקים הבית החזה מהלב אל הגזע הקלבאני עם זוג מספריים עדינים ולשים את העורקים לתוך הצלחת התרבות 6 ס מ תאים עם PBS. לחתוך לפתוח את העורקים longitudinally, לאורך העקומה הפחותה, ולאורך העקומה יותר עד מקטע ישר מתקיים. לחתוך לפתוח את שלושת הענפים של קשת אבי העורקים, כולל המנות, שמאל העורק המשותף והעורק השמאלי של ריחי עם מיקרו מספריים, כפי שמוצג באיור 2.
3. טיפול מקדים וכתמים של העורקים
- לחדור את העורקים עם 0.1% polyoxyethylene האתר של החברה ב PBS עבור 10 דקות ולחסום אותו עם 10% סרום עז רגיל מלוחים באגירה טריס (TBS) המכיל 2.5% polysorbate 20 עבור 1 h בטמפרטורת החדר בלוח 12-היטב תרבות התא.
- בשלב הבא, מודדת את העורקים עם 5 ג ' והארנב נגד ומטה-VCAM-1 ו-5 העכברוש g/mL anti-VE-cadherin רין במאגר חסימת, לילה ב 4 ° c.
- לאחר שטיפה לדוגמה 3x עם פתרון כביסה (TBS המכיל 2.5% polysorbate 20), להחיל את הנוגדנים בעלי מסגרת פלואורסצנטית משני (1:1000 דילול, אלקסה Fluor 555-התווית אנטי ארנבת IgG ו אלקסה Fluor 488-מתויג אנטי עכברוש IgG) עבור 1 h בחדר טמפרטורה. לשטוף את 3x בפתרון כביסה.
- להכתים את אבי העורקים עם 4 ', 6-diamidino-2-פניינילידול (DAPI) (1 μg/mL) עבור 10 דקות ולשטוף אותו 3x בפתרון כביסה.
4. הרכבה של העורקים על מגלשת הזכוכית
- מניחים את העורקים על שמיכות עם משטח הלומיאל כלפי מטה ולהעביר אותו לאט לפתרון ההרכבה אנטי לדעוך בעבר ירד על הכיסויים. מתחו בעדינות את העורקים. כדי לשמור על הדגימה שטוחה
- , הפוך את הסרבל. והניח אותו על הזכוכית הטיפול חייב להילקח כדי לא לאפשר בועות אוויר להישאר בין הדגימה לבין הזכוכית.
5. תצפית על העורקים
- בדקו את העורקים עם מיקרוסקופ. ממוקד לסריקת לייזר
- לנתח עוצמות צבע של ערוצים שונים מהאזור הרצוי בתמונות הפנים en עם תוכנת תמונה-Pro Plus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
העכבר בן 12 שבועות C57BL/6 מורדמים ומכיל עם תמיסת מלח רגיל המכיל 40 יחידות/mL הפארין ולאחר מכן, מקורר 4% פאראפורמלדהיד. העורקים של העכבר נחשף תחת מיקרוסקופ מבתר (איור 1), גזור, גזור longitudinally פתוח (איור 2). En הפנים אימונוofor, כתמים של התאים כלי הדם האנדותל בוצעה כמודגם באיור 3 ושולחן 1. En הפנים אימונוoforas של מכשיר דם הדבקה של חלבון -1 (VCAM-1) ביטוי עם VE-קדהרין כמו סמן אנדותל הוצג תחת דפוסי זרימה משתנים מאזורים שונים של העורקים העכבר. DAPI היה גם מוכתם להציג את גרעין התא להדמיה טובה יותר. התאים האנדותל והשרירים החלקים ניתן להבדיל בקלות מתוך המבנה של גרעין התאים כאשר מסתכלים דרך z-ערימות מתחת למיקרוסקופ מאז גרעיני התא אנדותל הם בצורת אליפסה גדול יותר מאשר ציר בצורת חלק גרעין תא השריר. הנציג en תמונות הפנים מוצגים באיור 4. העורקים נבדק על ידי LSM 710 לייזר סריקת מיקרוסקופ (טבלת חומרים) עם fluar 40x/1, 3 שמן עדשה. מן הפנים האנטי אימונוofor, אנו יכולים ברור וישירות להבחין כי הביטוי של VCAM-1 היה שופע יותר באזורים תחת זרם מופרע (עקמומיות פחותה של קשת העורקים) מאשר אלה תחת זרימה יציבה (עקמומיות גדול של קשת העורקים ואת העורקים החזי).
איור 1 : חשיפת העורקים של העכבר תחת מיקרוסקופ מבתר. הסר את רקמות החיבור לאורך העורקים בנקייה ככל האפשר. a = עורק להציע; b = עורק הראש המשותף והשמאלי; c = עורק תת-שמאלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2 : חיתוך של העכבר העורקים החזה וחיתוך אותו longitudinally. (א) עורק העורקים של בית החזה מהלב אל הגזע הקלבאני נחתך לאורך העקומה הפחותה longitudinally, ולאורך העקומה הגדולה, עד שהפלח הישר התקיים. שלושת הענפים של קשת אבי העורקים, כולל המנות, שמאל עורק הראש המשותף, ושמאל עורק תת-מימדי, נחתכו גם עם מיקרו מספריים. קווים אדומים מקווקווים מצביעים על קו החיתוך. (ב) אבהעורקים נפתח והתפשט בשטוח על מגלשות הזכוכית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3 : סכמה לפנים מאימונואופלואותצביעת של תאי כלי דם אנדותל. ראשית, לחלחל את העורקים עם 0.1% polyoxyethylene לחסום את האתר ב-PBS במשך 10 דקות ותחסום אותו עם 10% סרום עז רגיל ב-TBS המכיל 2.5% polysorbate 20 עבור 1 h בטמפרטורת החדר בלוח 12-היטב תרבות התא. בשלב הבא, מודנת את העורקים עם הנוגדן העיקרי במאגר חסימת לילה ב 4 ° c, ולשטוף אותו שלוש פעמים עם פתרון כביסה (TBS המכיל 2.5% polysorbate 20). לאחר מכן, להחיל נוגדנים משני מעלה מעלה על ידי הקרינה על 1 h בטמפרטורת החדר ולשטוף שלוש פעמים. מנוגד את העורקים עם DAPI במשך 10 דקות ולשטוף אותו שלוש פעמים בפתרון כביסה. בסופו של דבר, הבהר את העורקים על שקופית זכוכית ולהתבונן העורקים על ידי סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלית וקד. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
איור 4 : הנציג en פנים צביעת תוצאות. (א) בפנים immunofluorescence ניתוח של העקמומיות הפחותה של הבית העורקים של העכבר (d-flow אזורים) ואת עקמומיות גדול או בית העורקים החזה (s-זרם אזורים) כדי להשוות את ביטוי אנדותל vcam-1 תחת תבניות זרימה שונות. המבנה התאי של האנדותל מוצג על ידי כתמים של VE-קדהרין. (ב) שטחי ה-d-flow של הנציג (עקמומיות פחותה) ואזורי זרימה (עקמומיות גדולה יותר והאב-העורקים) מצוינים באמצעות חיצים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.
| צעד | תהליך | אגר | טמפרטורה | זמן |
| 1 | חדירות | 0.1% פוליקסילין אוטיל לאתר בערוץ הPBS | טמפרטורת החדר | 10 דקות |
| 2 | חסימת | 10% סרום עז רגיל בתוך טריס-מלוחים באגירה (TBS) המכיל 2.5% פוליסורbate 20 | טמפרטורת החדר | מיכל ברכה |
| 3 | נוגדן ראשון (5 גרם/mL) | חסימת מאגר | 4 מעלות צלזיוס | לילה |
| 4 | שטוף | TBS המכיל 2.5% polysorbate 20 | טמפרטורת החדר | 5 דקות, 3 פעמים |
| מיכל 5 | נוגדנים משניים פלואורסצנטית (1:1000) | חסימת מאגר | טמפרטורת החדר | מיכל ברכה |
| 6 | שטוף | TBS המכיל 2.5% polysorbate 20 | טמפרטורת החדר | 5 דקות, 3 פעמים |
טבלה 1: מידע מפורט על הפנים הצמודים . הליכים מוכללים
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האנדותל חשוף לגורמים רבים, הכוללים שומנים, מגשרים דלקתיים ונוזלים מדגישים1,11,12. התבוננות ישירה בתאי האנדותל באתרו מספקת את היתרונות המיוחדים לניתוח שינויים במבנה התאים, הצמתים הבינתאיים ודפוסי ביטוי המולקולה בתגובה לגירוי הפציעה.
מחקרים קודמים סיפקו שני שונים בפנים שונות אימונוהיסטוכימיים טכניקות כדי לבחון את האנדותל של קיר העורקים4,5. האחת היא להשיג מונוקאייר מונאולייר על ידי התפשטות האנדותל מהקיר על ידי טכניקה מיוחדת, אשר קשה לשלוט ויכול לגרום לאובדן של אנדותל הרבה באתרי ההסתעפות של עורק4. השני הוא לאורך כל הקיר העורקי כפי שתיארנו. ההכנה השלמה קלה לביצוע ויכולה לשמור על כל האנדותל של מונאולייר בארנבים וחולדות5,13. עם זאת, מפיץ את הדגימה כולה של אבי העורקים שטוח לא קל, וכישלון לעשות זאת עלול להשפיע במידה רבה על איכות ההתבוננות. הכנת הדגימה של אבי העורקים כפי שמתואר כאן, עם עקמומיות לחתוך לפתוח את פני השטח כלפי מטה על שמיכות, מקל להפיץ את הדגימה של אבי העורקים שטוח על הזכוכית שקופית. יתר על כן, מיקרוסקופ קונפוקלית בסריקת לייזר נדרש כדי להתמקד טוב יותר על מונאולייר התא הדק ברירית כלי הדם.
נקודת מפתח של טכניקה זו היא למתוח את הדגימה של אבי העורקים שטוח ככל האפשר כדי לקבל תצפית טובה יותר של אבי העורקים. בנוסף, יש להוסיף הפארין לתמיסת מלח רגילה לפני הפרזיה, והדגימה של אבי העורקים צריכה להיות מטופלת בעדינות לאורך כל התהליך. פאראפורמלדהיד צריך להיות טרי מוכן לשמור ב 4 ° צ' עד השימוש.
. יש מגבלות לטכניקה זו ראשית, היכולת של הפנים האנטי החיסונית לזהות חומר תת-מימי, כגון ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה, מוגבל כאשר לעומת אימונוהיסטוכימיה רגילה של מקטעי רקמות. שנית, אותות פלורסנט הולבן בקלות לאחר סריקה על ידי המיקרוסקופ קונפוקלית וקד, במיוחד בעת ביצוע ניתוח ציר z. יתר על כן, הביטוי של מולקולת היעד ניתן רק לכמת, על פי עוצמת הפלורסנט שלה.
לסיכום, זה שונה en הפנים immunofluorescence כתמי הטכניקה מספק דרך קלה לנתח את המבנה ואת ביטוי החלבון דפוס של תאים אנדותל כלי דם באזורים תחת דפוסי זרימת דם שונים6,7 ובפתוגנזה של טרשת עורקים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
. למחברים אין מה לגלות
Acknowledgments
מחקר זה היה נתמך על ידי הקרן הלאומית המדע הטבעי של סין (גרנט No. 81670451, 81770430), התוכנית העולה סטאר של שנגחאי (גרנט 171403000), והוועדה לטכנולוגיה מדע של הממשלה העירונית של שנגחאי (גרנט לא. 14441903002, 15411963700).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antifade mountant | Servicebio | G1401 | |
| Delicate Forceps | RWD Life Science | F11001-11 | |
| Delicate Scissors | RWD Life Science | S12003-09 | |
| Dissecting Forceps | RWD Life Science | F12005-10 | |
| Mciro Spring Scissors | RWD Life Science | S11001-08 | |
| Polyoxyethylene octyl phenyl ether (Triton X-100) | Amresco | M143 | |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Amresco | 0777 | |
| VCAM-1 antibody | Abcam | ab134047 | |
| VE-Cadherin antibody | BD Biosciences | 555289 | |
| Alexa Fluor 555 labeled anti-rabbit IgG | invitrogen | A-31572 | |
| Alexa Fluor 488 labeled anti-rat IgG | invitrogen | A-21208 | |
| Laser Scanning Microscope | Carl Zeiss |
References
- Gimbrone, M. A. Jr, Garcia-Cardena, G. Endothelial Cell Dysfunction and the Pathobiology of Atherosclerosis. Circulation Research. 118 (4), 620-636 (2016).
- Zhou, J., Li, Y. S., Chien, S. Shear stress-initiated signaling and its regulation of endothelial function. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 34 (10), 2191-2198 (2014).
- Tarbell, J. M. Shear stress and the endothelial transport barrier. Cardiovascular Research. 87 (2), 320-330 (2010).
- Warren, B. A. A method for the production of "en face" preparations one cell in thickness. Journal of Microscopy. 85 (4), 407-413 (1965).
- Azuma, K., et al. A new En face method is useful to quantitate endothelial damage in vivo. Biochemical and Biophysical Research Communications. 309 (2), 384-390 (2003).
- Son, D. J., et al. The atypical mechanosensitive microRNA-712 derived from pre-ribosomal RNA induces endothelial inflammation and atherosclerosis. Nature Communications. 4, 3000 (2013).
- Go, Y. M., et al. Disturbed flow enhances inflammatory signaling and atherogenesis by increasing thioredoxin-1 level in endothelial cell nuclei. PLOS ONE. 9 (9), e108346 (2014).
- Kundumani-Sridharan, V., Dyukova, E., Hansen, D. E. 3rd, Rao, G. N. 12/15-Lipoxygenase mediates high-fat diet-induced endothelial tight junction disruption and monocyte transmigration: a new role for 15(S)-hydroxyeicosatetraenoic acid in endothelial cell dysfunction. The Journal of Biological Chemistry. 288 (22), 15830-15842 (2013).
- Liu, Z. H., et al. C1q/TNF-related protein 1 promotes endothelial barrier dysfunction under disturbed flow. Biochemical and Biophysical Research Communications. 490 (2), 580-586 (2017).
- Wang, X. Q., et al. Thioredoxin interacting protein promotes endothelial cell inflammation in response to disturbed flow by increasing leukocyte adhesion and repressing Kruppel-like factor 2. Circulation Research. 110 (4), 560-568 (2012).
- Mitra, S., Deshmukh, A., Sachdeva, R., Lu, J., Mehta, J. L. Oxidized low-density lipoprotein and atherosclerosis implications in antioxidant therapy. The American Journal of the Medical Sciences. 342 (2), 135-142 (2011).
- Stancel, N., et al. Interplay between CRP, Atherogenic LDL, and LOX-1 and Its Potential Role in the Pathogenesis of Atherosclerosis. Clinical Chemistry. 62 (2), 320-327 (2016).
- Nerem, R. M., Levesque, M. J., Cornhill, J. F. Vascular Endothelial Morphology as an Indicator of the Pattern of Blood Flow. Journal of Biomechanical Engineering. 103 (3), 172-176 (1981).
